Develan nuevos mecanismos que regulan la pluripotencia en células madre embrionarias

En un estudio del Centro de Terapia Celular, que cuenta con el apoyo de la FAPESP, se identificaron moléculas de ARNs implicadas en el mantenimiento de la pluripotencia y en la diferenciación celular. Este descubrimiento posibilita la creación de drogas capaces de hacer que las CMEs regresen al estadio más inicial de desarrollo

Karina Toledo | Agência FAPESP – Las células madre embrionarias (CMEs), capaces de originar diferentes tejidos del cuerpo humano, se erigieron durante el viraje del siglo como una esperanza de tratamiento para diversas condiciones de salud. Con todo, a medida que las investigaciones fueron avanzando, se percibió que la comprensión y el control del comportamiento de esas células constituiría un reto mayor que el que se imaginara inicialmente.

Estudios realizados demostraron que una misma población de CMEs puede ser bastante heterogénea y que el potencial de pluripotencia, es decir, la capacidad de diferenciarse en los más diversos tipos celulares, podría variar entre las células provenientes de un mismo embrión y aún más entre distintos linajes. Y posteriormente se descubrió que, a medida que la diferenciación avanza, se altera en el interior de las células madre el nivel de ciertos micro-ARNs, pequeñas moléculas de ARN que no codifican proteínas, pero que cumplen una función regulatoria en diversos procesos intracelulares.

Al estudiar más pormenorizadamente el papel de 31 de esos micro-ARNs observados en las CMEs humanas, científicos del Centro de Terapia Celular (CTC) de Ribeirão Preto, en Brasil, identificaron vías de señalización implicadas tanto en el mantenimiento de la pluripotencia como en la inducción del proceso de diferenciación, un descubrimiento que abre nuevas perspectivas para las investigaciones en el área.

Los resultados de este estudio, que contó con el apoyo por la FAPESP, se dieron a conocer en la revista Stem Cell Research & Therapy. El CTC es un Centro de Investigación, Innovación y Difusión (CEPID) financiado por la FAPESP cuya sede se encuentra en la Universidad de São Paulo (USP).

“Con base en esta información, podemos pensar en el desarrollo de drogas con miras a facilitar el cultivo de CMEs en laboratorio e incluso para hacer que esas células regresen al estadio más inicial de desarrollo, denominado naïve, en el cual la capacidad de originar cualquier tipo de tejido es mayor”, dijo Rodrigo Alexandre Panepucci, investigador de la Fundación Hemocentro de Ribeirão Preto y coordinador del trabajo.

Según Panepucci, de manera general las CMEs humanas que se utilizan en investigaciones se encuentran en un estadio de desarrollo conocido como primed pluripotency, aún no diferenciadas, pero con una tendencia a avanzar por determinados caminos de diferenciación. Son por ende menos versátiles que las células madre embrionarias de ratones, normalmente aisladas en el estadio naïve y, por tal motivo, muy utilizadas como modelo de estudio.

“Existe un gran interés en trabajar con el fenotipo naïve, pues son células capaces de originar incluso gametos [óvulos y espermatozoides], cosa que las células primed no pueden hacer”, dijo el investigador.

Análisis a gran escala

Al exhibir una secuencia de nucleótidos complementaria, el micro-ARN logra unirse al ARN mensajero y hacer que este se degrade o impedir su traducción en proteína. Por ende, cuando existe un aumento en la expresión de micro-ARNs en la célula, esto significa que algún proceso está siendo inhibido. Pero la detección de este proceso no constituye precisamente una labor trivial.

“Un solo micro-ARN puede ser capaz de unirse a centenas o a miles de ARNs mensajeros distintos. Puede afectar a varios blancos de una vía de señalización y puede tener un efecto biológico amplio”, explicó Panepucci.

El estudio de esas moléculas desde el punto de vista funcional requiere por lo tanto la aplicación de herramientas de bioinformática que permitan trabajar con un gran volumen de datos. El grupo del CTC adoptó una metodología conocida como High Content Screening (HCS, cribado de alto contenido), que permite analizar miles de imágenes distintas, a los efectos de descubrir de qué manera regula cada micro-ARN el fenotipo de las CMEs.

Las células madre quedaron dispuestas en placas con 96 pequeños pozos de cultivo. En cada pozo se introdujo una molécula de micro-ARN sintético distinta. Al cabo de tres o cuatro días de cultivo, los investigadores evaluaron el efecto, ya sea en el mantenimiento de la pluripotencia o en la inducción de la diferenciación.

“Utilizamos microscopía de fluorescencia automatizada para obtener miles de imágenes de las células. Con base en el análisis de ese material, establecimos un perfil multiparamétrico para determinar el estadio de pluripotencia. Es decir, entre centenas de parámetros morfológicos observados en las imágenes, seleccionamos alrededor de 10 que permiten clasificar el estadio de diferenciación en el cual se encuentran las células madre”, explicó el investigador.

Asimismo, el grupo midió en cada pozo el nivel de dos proteínas consideradas marcadores de pluripotencia: OCT4 y ciclina B1. Cuanto mayor es la expresión de esas moléculas, mayor es el grado de pluripotencia de la célula.

Luego los micro-ARNs que indujeron efectos similares en las células madre fueron agrupados y jerarquizados mediante el empleo de una técnica de análisis conocida como clusterización. De este modo, fue posible organizar el gran volumen de información obtenida mediante los análisis e identificar a qué vías de señalización estaba relacionado cada grupo de micro-ARNs.

“Seleccionamos para realizar un estudio más profundizado el miR-363-3p, que claramente contribuye al mantenimiento de la pluripotencia. Demostramos que el efecto de inhibición de la diferenciación se concreta mediante la degradación del ARN mensajero que codifica a la proteína NOTCH1”, dijo Panepucci.

De acuerdo con el investigador, los compuestos inhibidores de la vía de señalización mediada por NOTCH1 pueden convertirse en herramientas capaces de modular el potencial de pluripotencia de las CMEs y permitirles incluso retrotraerse al estadio naïve, en el cual altos niveles de OCT4 y demás factores de pluripotencia se encuentran presentes.

“La compresión de estos mecanismos de regulación de la pluripotencia puede elevar a un nuevo nivel a las investigaciones con CTEs y también a aquellas con células iPS [células madre pluripotentes inducidas, obtenidas partiendo de células adultas de pacientes y modificadas en laboratorio], de las cuales depende el futuro de la terapia celular”, dijo Panepucci.

Según el investigador, las células iPS poseen la ventaja de albergar en su núcleo el mismo ADN del paciente que será tratado. Asimismo, por derivar de células adultas y no de embriones humanos, no existen limitaciones éticas para su aplicación en medicina. “Así y todo, las células madre embrionarias aún constituyen el mejor modelo de estudio de la pluripotencia”, afirmó.

La investigación que originó el artículo publicado en Stem Cell Research & Therapy se llevó a cabo durante el doctorado de Ildercílio Mota de Souza Lima, becario de la FAPESP. Actualmente, durante la maestría de Amanda Cristina Corveloni, el grupo investiga más profundamente los mecanismos moleculares implicados en la transición entre el estado primed y el estado naïve de CMEs.

Puede leerse el artículo intitulado High-content screen in human pluripotent cells identifies miRNA-regulated pathways controlling pluripotency and differentiation, de Ildercílio Mota de Souza Lima, Josiane Lilian dos Santos Schiavinato, Sarah Blima Paulino Leite, Danuta Sastre, Hudson Lenormando de Oliveira Bezerra, Bruno Sangiorgi, Amanda Cristina Corveloni, Carolina Hassibe Thomé, Vitor Marcel Faça, Dimas Tadeu Covas, Marco Antônio Zago, Mauro Giacca, Miguel Mano y Rodrigo Alexandre Panepucci, en el siguiente enlace: https://stemcellres.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13287-019-1318-6.