El congelamiento de células de sangre puede alterar los estudios sobre el lupus

Un experimento muestra que la criopreservación altera el índice de apoptosis y la proliferación de linfocitos en portadores de esta enfermedad autoinmune

Por Karina Toledo

Agência FAPESP – La congelación de muestras de células de sangre de voluntarios para análisis futuros constituye una práctica común en la investigación clínica, pero puede distorsionar los resultados en los estudios con portadores de lupus, de acuerdo con un experimento realizado en la Universidad Federal de São Paulo (Unifesp), en Brasil.

Al comparar muestras sanguíneas frescas y congeladas de pacientes acometidos por esta enfermedad autoinmune, los investigadores observaron diferencias en los índices de proliferación de algunas de las células del sistema inmunológico: los linfocitos TCD4.

“Datos existentes en la literatura científica sugieren que los linfocitos de portadores de lupus son más frágiles y exhiben una mayor tendencia a la apoptosis [la muerte celular programada]. Nuestra hipótesis indica que las células más débiles murieron durante el proceso de criopreservación, y eso creó un sesgo de selección positiva. Sólo las más fuertes estaban proliferando luego de la descongelación y, por ese motivo, el índice fue superior al de las muestras frescas”, dijo Luis Eduardo Coelho Andrade, jefe del Laboratorio de Inmunorreumatología de la Unifesp.

Con el apoyo de la FAPESP, Coelho Andrade coordina un proyecto cuyo objetivo consiste en entender el funcionamiento de los linfocitos TCD4 –particularmente los subtipos Th1, Th2, Th17 y T reguladores (Treg)– en pacientes con lupus.

Esta enfermedad no tiene una causa conocida y se caracteriza por el ataque del sistema inmunológico contra tejidos sanos del cuerpo. Los blancos más comunes son la piel, las articulaciones, los riñones y el cerebro, pero otros órganos también pueden ser acometidos.

“Para congelar y descongelar las muestras sanguíneas muy lentamente, de manera tal de no dañarlas, existen protocolos. Sin embargo, por mayor que sea el cuidado, las células están llenas de agua y se forman cristales de hielo en su interior. Algunas funciones pueden alterarse, por eso queríamos ver el efecto de la criopreservación sobre las células Th1, Th2, Th17 y Treg”, comentó Coelho Andrade.

Se extrajeron muestras de sangre de 20 portadores de lupus y de 18 voluntarios sanos agrupados en pares por sexo y edad. Una parte de las muestras de cada grupo se congeló y las demás se usaron inmediatamente en ensayos de proliferación celular y observación de apoptosis.

“La criopreservación elevó el índice de apoptosis tanto en los linfocitos de voluntarios sanos como en los de pacientes con lupus. Pero el incremento de la apoptosis fue mucho más evidente en las células de los lúpicos”, afirmó Coelho Andrade.

Curiosamente, la congelación hizo aumentar el índice de proliferación de los linfocitos Th2, Th17 y Treg de los portadores de lupus. En tanto, los índices de proliferación de las células Th1 congeladas eran iguales a los de las muestras frescas. En los cultivos con células de voluntarios sanos, el índice de proliferación aumentó con el congelamiento únicamente en el caso de los linfocitos Th1.

“Estimamos que las células T sabidamente más frágiles en los pacientes con lupus habrían muerto durante el congelamiento, y al descongelarlas quedaron únicamente las más fuertes en las muestras. En tanto, en las muestras frescas había tanto células más viables como degeneradas, que no logran proliferar”, dijo Coelho Andrade.

Estos resultados –que saldrán publicados en poco tiempo más en la revista Cryobiology– indican que la criopreservación tiene un impacto significativo en los resultados y afecta de modo distinto a las células de personas con y sin lupus.

“Esto explica en parte la controversia existente en la literatura relacionada con los estudios funcionales de células de portadores de lupus. Sabemos que parte de los trabajos se concretó con muestras de sangre frescas, y otra parte con muestras congeladas”, sostuvo el investigador.

Para Coelho Andrade, en las investigaciones sobre lupus, no sería recomendable utilizar muestras criopreservadas. “Puede ocurrir incluso que en un determinado experimento ese sesgo de selección positiva sea deseable, pero se debe tener conciencia de ese factor a la hora de diseñar el estudio”, dijo.

Diferencias en el suero

En otro brazo del proyecto de la Unifesp, se realizaron experimentos con el objetivo de poner a prueba una teoría propuesta en estudios anteriores, que indica que el suero sanguíneo de portadores de lupus contendría factores que estimulan la apoptosis de los linfocitos.

“La cantidad de linfocitos circulantes suele ubicarse por debajo de lo normal en los pacientes con lupus. Y cuando aislamos esas células y empezamos a trabajar con ellas en el laboratorio, es posible observar que ya se están degenerando y se muestran sensibles a cualquier procedimiento. Procuramos entender por qué sucede eso”, comentó Coelho Andrade.

Los investigadores extrajeron suero de 23 portadores de la enfermedad autoinmune y de una cantidad equivalente de voluntarios sanos agrupados en pares por sexo y edad.

“Hicimos un pool de suero lúpico y uno de suero sano. Entonces agarramos los linfocitos de cada individuo y los pusimos en cultivo con cada uno de los sueros para hacer un seguimiento de los índices de apoptosis”, comentó Coelho Andrade.

Al incubar linfocitos TCD4 indiferenciados con el suero de pacientes sanos, el índice de apoptosis su ubicó en un 1,8% aproximadamente. Dicho porcentaje se elevó al 5,5% cuando las células se incubaron con el suero de los pacientes con lupus. Ese incremento aproximadamente triplicado se observó tanto en los linfocitos de pacientes con lupus como en los de los voluntarios sanos.

Con todo, al observar los linfocitos ya diferenciados en células Th1, Th2, Th17 y Treg, no se registró la elevación del índice de apoptosis inducida por el suero lúpico.

“Estos resultados sugieren que existe algún factor en el suero sanguíneo de los pacientes lúpicos que induce la apoptosis de los linfocitos, pero no afecta a las células diferenciadas. Nuestro próximo paso consistirá en detectar qué moléculas existentes en el suero son las responsables de ese efecto”, comentó Coelho Andrade.

Desequilibrio

En un tercer brazo del proyecto, el grupo coordinado por Coelho Andrade evaluó la distribución de los distintos tipos de linfocitos en muestras de sangre y de orina de portadores de nefritis lúpica, una de las manifestaciones más graves de la enfermedad, que puede llevar a la insuficiencia renal y a la muerte.

Con la ayuda de un citómetro de flujo –un aparato que permite diferenciar por inmunofluorescencia cada tipo de célula presente en una solución– el grupo evaluó cómo se encontraba la proporción entre células efectoras (Th1, Th2 y Th17), que estimulan la inflamación, y células reguladoras (Treg), cuya acción es inmunosupresora.

Los resultados salieron en artículos de las publicaciones Brazilian Journal of Medical and Biological Research y Scandinavian Journal of Rheumatology.

“Al analizar la sangre, observamos que la frecuencia de células Treg en el lupus (1,4%) es análoga a los índices normales (1,1%). No obstante, el índice de células T efectoras es mayor en el lupus (10,8%) en comparación con los índices normales (6,1%). Por ende, la relación entre células efectoras y células reguladoras se encuentra desbalanceada en el lupus, lo cual probablemente favorece la respuesta autoinmune que se observa en esta enfermedad”, explicó Coelho Andrade.

Aparte de las diferencias cuantitativas, este experimento reveló que los linfocitos efectores de los pacientes con lupus también expresaban una mayor cantidad de moléculas funcionales, es decir, se encontraban más activos que los linfocitos efectores de los voluntarios sanos.

Los científicos observaron en los portadores de nefritis lúpica –pero no en pacientes con otros tipos de nefropatía– una correlación inversa: cuanto mayor era el nivel de células Th1 en la orina, menor era el nivel en la sangre. Se detectó también una fuerte tendencia a hallar niveles reducidos de células Treg en la orina de los pacientes con nefritis lúpica. Para Coelho Andrade, este dato puede servir como biomarcador para medir la inflamación en el tejido renal.

“El proceso inflamatorio no está ocurriendo en la sangre sino en el tejido renal, y la orina expresa teóricamente lo que pasa en los riñones. Por lo tanto, si tengo una infiltración grande de células Th1 en el tejido renal, lo esperable es que haya una cantidad mayor en la orina que en la sangre periférica. Entre tanto, cuando el proceso inflamatorio es menos intenso en ese tejido, la proporción de Th1 en la sangre será mayor”, explicó.

En estos momentos, el grupo se aboca a estandarizar el test de inmunocitoquímica (una técnica en la que se emplean anticuerpos para detectar células) con tejidos recolectados mediante biopsias renales, para observar la frecuencia de cada uno de los subtipos de linfocitos. “Esperamos que los resultados reflejen lo que se observó en la orina. Así podremos estar seguros de este razonamiento”, dijo Coelho Andrade.