FAPESP apoia o desenvolvimento de nove vacinas contra a COVID-19

Além da CoronaVac, dois imunizantes estão sendo testados no Instituto Butantan. Quatro projetos são conduzidos na USP e outros dois em startups apoiadas pelo PIPE

Elton Alisson e Karina Toledo | Agência FAPESP – Além de apoiar os ensaios clínicos de fase 3 da CoronaVac, no Instituto Butantan, a FAPESP financia outros oito projetos de pesquisa voltados ao desenvolvimento de vacinas contra a COVID-19.

Parte das formulações está em fase de testes em animais, com perspectivas de iniciar os ensaios clínicos no próximo ano. Quatro projetos estão em desenvolvimento na Universidade de São Paulo (USP), dois no Instituto Butantan e outros dois em startups apoiadas pelo Programa FAPESP Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas (PIPE).

No Instituto do Coração (InCor) da Faculdade de Medicina (FM-USP), a equipe coordenada por Jorge Elias Kalil Filho desenvolve uma vacina de DNA em spray nasal que combina uma parte da proteína spike – usada pelo SARS-CoV-2 para se conectar com o receptor da célula humana e viabilizar a infecção – com epítopos T (antígenos virais que são reconhecidos pelo sistema imune). O objetivo é induzir, ao mesmo tempo, uma resposta de anticorpos neutralizantes e uma forte imunidade celular, incluindo linfócitos T CD8+ citotóxicos, que matam células infectadas, e linfócitos T CD4+, que ajudam na produção de anticorpos e nas respostas citotóxicas.

A proteína formada pela mistura desses dois componentes será produzida em células por meio da tecnologia de DNA recombinante e carreada em nanopartículas que aderem à mucosa nasal para desencadear uma reposta imune e impedir que o vírus se espalhe para todo o trato respiratório.

Em contato com a mucosa nasal, a nova proteína induzirá a produção de uma grande quantidade de anticorpos específicos, tais como a imunoglobulina A (IgA) secretória, e estimulará células T no trato respiratório.

De acordo com Kalil Filho, coordenador do projeto intitulado “Mapeamento de epítopos do vírus SARS-CoV-2 para linfócitos T e do receptor da proteína spike para linfócitos B”, algumas das vantagens da nova vacina em relação às de primeira geração é que, por ter alvos moleculares direcionados, deverá induzir uma resposta imune mais forte, além de ser estável a temperatura ambiente.

“Ainda não se sabe se as vacinas já disponíveis evitam a infecção nasal. Por isso, optamos por desenvolver uma formulação capaz de ser administrada por essa via, para fortalecer a mucosa do sistema respiratório e não deixar o vírus se proliferar”, explica Kalil Filho à Agência FAPESP.

Para definir os alvos moleculares da nova vacina, os pesquisadores estudaram a resposta imunológica de 200 pessoas que adoeceram em razão da infecção pelo novo coronavírus. Com base nessas análises, desenvolveram diferentes composições do imunizante, já testadas em camundongos para definir o melhor antígeno, formulação e nanopartícula. “Já temos o que chamamos de um protótipo vacinal”, afirma Kalil Filho.

Os pesquisadores estão trabalhando agora na obtenção de uma linhagem celular que permita produzir a nova proteína em larga escala para industrialização. A perspectiva é iniciar os testes em humanos em 2022.

A vacina poderá ser administrada como uma dose de reforço dos imunizantes já existentes, uma vez que quando for lançada a maior parte da população já deverá estar vacinada. “Ela poderia ser utilizada para induzir uma reposta local muito forte e atuar como um reforço da memória imune”, diz Kalil Filho.

Outra ideia é combiná-la com uma vacina intranasal bivalente utilizando vírus influenza para expressar a proteína spike do SARS-CoV-2. Essa estratégia está sendo desenvolvida por pesquisadores da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP, sob a liderança do pesquisador Ricardo Tostes Gazzinelli.

“A vantagem de combinar as duas vacinas é aumentar a resposta imune”, afirma Kalil Filho.

Genética reversa

Gazzinelli é responsável pelo projeto “Vacina intranasal bivalente utilizando vírus influenza expressando a proteína S (spike) do SARS-CoV-2: mecanismos de proteção e lesão pulmonar”.

O desafio é desenvolver uma vacina de DNA baseada na genética reversa do influenza, em que um gene essencial para a saída do vírus causador da gripe da célula hospedeira é substituído por um gene que codifica um segmento da proteína spike, o RBD (domínio de ligação ao receptor, na sigla em inglês, a ponta da molécula que se conecta à célula hospedeira).

O vírus não replicante gerado age infectando as células da mucosa nasal, expressando as proteínas do próprio influenza e a proteína spike, sem sair do seu interior. Dessa forma, induz a resposta imune e não causa a doença.

Em uma primeira etapa, os pesquisadores geraram por genética reversa o vírus influenza expressando RBD e administraram por via nasal em camundongos. Os resultados dos testes de imunogenicidade indicaram que os vírus induziram a produção de anticorpo anti-RBD no lavado broncoalveolar (BALF) e no soro dos animais imunizados, assim como uma forte resposta de linfócitos T específicos.

A resposta de indução de produção de anticorpos, contudo, ainda não é satisfatória. “Estamos tentando melhorar a formulação para que a vacina induza um nível de anticorpos maior”, diz Gazzinelli à Agência FAPESP.

Após a conclusão dessa etapa, os pesquisadores pretendem realizar novos testes em animais imunizados que serão desafiados com o SARS-CoV-2. A perspectiva é iniciar os testes clínicos em 2022.

Além da inoculação da vacina pela via intranasal, também tem sido testada a administração da vacina de forma injetável (intramuscular).

De acordo com Gazzinelli, a técnica de genética reversa utilizada permite trocar a hemaglutinina – principal alvo dos anticorpos contra o vírus influenza sazonal. Dessa forma, o imunizante poderá ser bivalente, conferindo proteção tanto contra a COVID-19 como contra a gripe sazonal.

Outra vantagem, segundo ele, é evitar o chamado prime-boost homólogo – problema caracterizado pela diminuição da eficácia da segunda dose da vacina, como ocorre normalmente com os imunizantes que usam adenovírus como vetores, causado pelo desenvolvimento de anticorpos contra o vetor viral.

“No caso de vacinas contra a COVID-19 que usam adenovírus como vetores, como a Sputnik, esse problema é superado pela troca do adenovírus na segunda dose. Já no caso da vacina que estamos desenvolvendo, isso é solucionado pela troca da hemaglutinina de um ano para o outro, porque o imunizante acaba funcionando como se tivesse dois vírus diferentes”, explica Gazzinelli.

A possibilidade de utilizá-la como reforço da vacina em desenvolvimento pelo grupo do professor Kalil Filho, no InCor, também permitiria evitar esse problema, afirma o pesquisador. “Quando as duas estiverem funcionando, vamos testá-las juntas e separadas para verificarmos qual a melhor estratégia para administrá-las”, conta.

Partículas semelhantes a vírus

O projeto de pesquisa liderado por Gustavo Cabral de Miranda no Instituto de Ciências Biomédicas (ICB) da USP visa desenvolver um imunizante usando partículas semelhantes a vírus (VLPs, na sigla em inglês).

Essas partículas possuem características semelhantes às de peptídeos e proteínas virais, como a spike – usada pelo novo coronavírus para se conectar a um receptor nas células humanas e infectá-las. Por isso, são facilmente reconhecidas pelo sistema imune. Porém, não têm material genético do patógeno, o que as torna seguras para o desenvolvimento de vacinas.

A fim de permitir que sejam reconhecidas pelo sistema imunológico e gerem uma resposta contra o coronavírus, as VLPs são inoculadas juntamente com antígenos – substâncias que estimulam o sistema imune a produzir anticorpos. Dessa forma, é possível unir as características de adjuvante das VLPs com a especificidade do antígeno. Além disso, as VLPs, por serem componentes biológicos naturais e seguros, são facilmente degradadas, explica Miranda.

“Com essa estratégia é possível direcionar o sistema imunológico para reconhecer as VLPs conjugadas a antígenos como uma ameaça e desencadear a resposta imune de forma eficaz e segura”, afirma o pesquisador.

O grupo desenvolveu diferentes formulações de vacinas, já testadas em animais. Uma delas, baseada no segmento RBD da proteína spike, demonstrou ter capacidade de induzir resposta imunológica e de neutralizar o vírus.

“Os resultados dos testes em animais indicaram que essa formulação é capaz de neutralizar o vírus com duas doses. Pretendemos, nos próximos dois meses, melhorar a formulação para conseguir obter os mesmos resultados com apenas uma dose”, conta Cabral à Agência FAPESP.

A próxima etapa será a de desenvolvimento de uma linhagem celular que permita a produção da proteína em larga escala. A previsão é iniciar os testes em humanos em 2022.

De acordo com o pesquisador, algumas das vantagens da tecnologia em relação às demais vacinas é que, em razão de sua plasticidade, pode ser facilmente utilizada para o desenvolvimento de vacinas contra outros vírus, como zika, chikungunya ou dengue.

Modificação genética de proteínas

O outro projeto em andamento no ICB-USP, intitulado “Desenvolvimento de nanovacinas SAPN contra SARS-CoV-2 utilizando os antígenos estruturais S e N”, está sendo desenvolvido no âmbito do pós-doutorado de Marianna Favaro. O pesquisador responsável é Luis Carlos de Souza Ferreira.

“Nosso trabalho consiste em modificar geneticamente proteínas do vírus para que adquiram a capacidade de se auto-organizarem em uma nanopartícula com estrutura tridimensional muito mais parecida com a morfologia dos vírus e, portanto, com capacidade de interagir melhor com o sistema imune”, conta Favaro. Essa estratégia mimetiza características do vírus, como tamanho e apresentação repetida de antígenos, que são naturalmente reconhecidas pelo sistema imunológico como sinais de patógenos e que ativam a resposta imune.

Os pesquisadores já tinham empregado essa estratégia em pesquisas voltadas ao desenvolvimento de uma vacina contra o vírus zika. “Observamos um grande aumento na resposta mediada por anticorpos. Vale ressaltar que existem estratégias parecidas, como as VLPs, que já são usadas comercialmente contra hepatite B e HPV. A diferença principal é que nas VLPs se utilizam sequências já existentes na natureza que possuem a capacidade natural de autoestruturar, enquanto aqui utilizamos sequências sintéticas desenvolvidas para esse fim”, compara.

Favaro destaca que as vacinas com capacidade de se autoestruturar em nanopartículas representam um avanço principalmente em relação às vacinas de subunidade, que empregam apenas proteínas específicas dos patógenos. “As vacinas de subunidade são uma alternativa muito segura por não utilizarem vírus inteiros, o que facilita sua produção, mas podem apresentar menor eficiência. Essa dificuldade pode ser combatida justamente com a utilização de adjuvantes e nanopartículas que, como vantagem adicional, não demandam estruturas complexas de produção ou laboratórios de alta segurança, podendo ser produzidos no Brasil sem grandes obstáculos.”

No momento, a pesquisa está em fase de testes pré-clínicos. “Desenvolvemos formulações baseadas em diferentes proteínas do vírus e algumas delas já foram caracterizadas e avaliadas em camundongos quanto a sua capacidade de induzir uma resposta imunológica. Para outras formulações, sobretudo as baseadas na proteína spike do SARS-CoV-2, encontramos alguns obstáculos na produção e estamos adaptando o sistema de expressão para melhorar a qualidade dos anticorpos induzidos”, diz Favaro.

Plataforma adaptável a novas variantes

No Instituto Butantan, além da vacina CoronaVac, dois outros projetos estão em curso. O primeiro é liderado pela pesquisadora Soraia Attie Calil Jorge e tem como objetivo desenvolver uma plataforma para a produção de VLPs do SARS-CoV-2.

A principal vantagem desse tipo de tecnologia, segundo a pesquisadora, é que ela evita que o próprio vírus seja manipulado, o que no caso do SARS-CoV-2 exige uma estrutura laboratorial com alto nível de biossegurança, disponível em poucos centros de pesquisa. Outra vantagem é o fato de as VLPs apresentarem o antígeno ao sistema imune de forma muito parecida à que o vírus apresenta, o que estimula tanto a resposta imune humoral quanto a celular. “Além disso, trata-se de um sistema em que se pode modificar a VLP rapidamente, o que é bastante vantajoso no caso de surgirem variantes capazes de driblar a proteção conferida pelas vacinas atuais.”

O grupo liderado por Jorge já “construiu” os vetores e já tem os genes estruturais do SARS-CoV-2 inseridos no genoma do baculovírus (que funciona como um serviço de transporte dos genes para o interior das células, onde as VLPs serão produzidas).

“Estamos iniciando a produção das VLPs nas células e assim que elas estiverem caracterizadas serão testadas em animais. Já temos VLPs para o vírus da raiva, zika, Mayaro e chikungunya produzidas com essa tecnologia em nosso laboratório e confiamos que em breve teremos sucesso também com as VLPs de SARS-CoV-2.” A expectativa é que demore pelo menos um ano até a obtenção de aprovação para os testes em humanos.

Indução de resposta imune

O segundo projeto do Instituto Butantan é coordenado por Luciana Cezar de Cerqueira Leite e combina duas tecnologias: vesículas de membrana externa de bactéria, que são nanopartículas que imitam uma infecção, ativando eficientemente o sistema imunológico, acopladas às proteínas do SARS-CoV-2. O objetivo é induzir uma resposta imunológica ampla, de anticorpos e celular.

“Camundongos imunizados com essa vacina produziram uma quantidade cem vezes maior de anticorpos e uma resposta mediada por células, ambas importantes na proteção contra o vírus”, afirma.

O grupo de pesquisadores está agora na fase de produção do imunizante. “Já temos as nanopartículas e estamos purificando as proteínas para acoplar. Os camundongos, em seguida, serão imunizados para verificar a capacidade de produção de anticorpos neutralizantes e proteção. Esperamos começar esses testes no segundo semestre. Se os resultados se mostrarem promissores, teremos que fazer a produção com boas práticas de fabricação e obter a aprovação da Anvisa [Agência Nacional de Vigilância Sanitária] para poder realizar os ensaios clínicos.”

Produção de citocinas

O sétimo projeto de desenvolvimento de vacinas contra a COVID-19 está sendo desenvolvido pela Imunotera Soluções Terapêuticas – uma spin-off da USP apoiada pelo Programa Pesquisa Inovativa em Pequenas Empresas (PIPE) da FAPESP –, sob a coordenação de Luana Raposo de Melo Moraes Aps.

O projeto prevê o desenvolvimento de uma vacina de DNA capaz de induzir respostas imunológicas celulares contra o SARS-CoV-2 adequadas à genética da população brasileira.

A estratégia é baseada no desenho de sequências-alvo que incluem os epítopos do novo coronavírus (a menor parte do antígeno capaz de gerar resposta imune) mais reconhecidos pelos linfócitos T – que conferem imunidade celular contra o SARS-CoV-2 ao efetuar respostas antivirais por meio da produção de citocinas ou eliminação de células infectadas.

Os pesquisadores adaptaram uma tecnologia de geração de linfócitos T já utilizada para desenvolver, também com apoio do PIPE-FAPESP, uma vacina de DNA e uma proteína recombinante purificada capaz de direcionar e ativar o sistema imunológico, que mostraram ser eficazes para combater o câncer de colo de útero induzido pelo HPV. O imunoterápico na forma de proteína recombinante purificada foi testado em pacientes com lesões pré-cancerígenas causadas pelo HPV, atendidas no Hospital das Clínicas da FM-USP, com bons resultados.

Para desenvolver a vacina contra a COVID-19, foram selecionadas inicialmente as sequências de antígenos leucocitários humanos (HLA, na sigla em inglês) – grupo especial de proteínas localizadas na superfície de quase todas as células do corpo humano – mais frequentes na população brasileira para identificar os epítopos mais facilmente reconhecidos pelos linfócitos T, especialmente os CD8+.

“Focamos inicialmente na população brasileira porque, quando submetemos o projeto, ainda não estava disponível no Brasil nenhuma vacina contra a COVID-19. Mas a vacina poderá ser utilizada por qualquer população, uma vez que os HLAs que selecionamos são frequentes em outras populações, como a americana”, diz à Agência FAPESP Aps, uma das fundadoras da Imunotera.

Segundo ela, uma das vantagens de a vacina se basear no perfil genético populacional é que a resposta imune é mais bem direcionada, o que aumenta as chances de o imunizante funcionar.

A vacina já foi testada em camundongos, nos quais foram administradas duas doses, e a resposta imunológica foi avaliada duas semanas após a administração da segunda dose. Os resultados dessa prova de conceito de imunogenicidade da vacina foram satisfatórios.

Os pesquisadores pretendem realizar, agora, testes em animais infectados com o SARS-CoV-2 e têm perspectiva de iniciar os testes em humanos em 2022.

Segundo a pesquisadora, uma das principais vantagens da nova vacina em relação às de primeira geração é que ela tem potencial para neutralizar as variantes do SARS-CoV-2, uma vez que as mutações do novo coronavírus ocorrem na proteína spike, que não é o alvo do imunizante em desenvolvimento.

“Isso precisará ser confirmado por meio de análises genéticas. Mas a formulação vacinal que estamos desenvolvendo tem potencial para superar as limitações das vacinas atuais e funcionar para todas as variantes, sendo capaz de induzir uma resposta celular robusta na população brasileira”, estima Aps.

Outra vantagem da vacina, que será injetável e administrada em duas doses, é sua estabilidade em temperatura ambiente.

Além da vacina de DNA contra a COVID-19, a empresa está desenvolvendo um imunizante baseado em RNA que, de acordo com Aps, também demonstrou ser muito promissor.

Vacina oral

Outro projeto desenvolvido no âmbito do PIPE é o da Invent Biotecnologia, de Ribeirão Preto, que tem Marcel Montels Trevisani como pesquisador principal.

A empresa usa uma plataforma vacinal baseada em uma bactéria viva atenuada, que coloniza por um curto período de tempo os órgãos linfoides associados ao intestino, além de órgãos linfoides secundários de animais. “Esse vetor vacinal é modificado geneticamente e leva consigo genes que induzem a expressão de proteínas do SARS-CoV-2. Se o plano for exitoso, esse conjunto estimulará uma resposta imune celular e humoral contra o SARS-CoV-2, não permitindo o desenvolvimento da COVID-19”, resume Trevisani.

Por tratar-se de um vetor baseado em uma bactéria viva, essa fase inicial da pesquisa depende apenas de um fermentador para fazer crescer a bactéria de forma a ganhar escala de produção. A metodologia já é conhecida e testada. “Essa plataforma já foi utilizada para a prevenção de uma pneumonia equina, causada por Rhodococcus equi, com depósitos de patente no Brasil e no exterior”, explica.

No caso da pneumonia equina, todos os testes e protocolos constituídos ao longo do tempo de pesquisa demostraram que o vetor foi capaz de colonizar os órgãos linfoides associados ao intestino, além de outros órgãos linfoides secundários, por um período de tempo suficiente para a maturação e seleção de clones altamente capacitados para o controle da infecção provocada pelo R. equi.

Além disso, os pesquisadores notaram uma grande produção de IgA (imunoglobulina responsável pela proteção de mucosas), IgG (imunoglobulina importante para a neutralização de agentes infecciosos), junto com uma forte resposta imune celular capaz de levar à morte celular as células infectadas. “Com base nessas experiências previamente obtidas, nossa expectativa é que o mesmo ocorra para a prevenção contra o SARS-CoV-2”, explica Trevisani.

“Estamos num período de construção da plataforma vacinal e avaliação de expressão. O cronograma prevê o início da experimentação em animais para agosto de 2021. No entanto, com a experiência adquirida utilizando a plataforma para R. equi, pudemos observar uma forte resposta imune humoral, de mucosa e celular, chegando a ser considerada pela comunidade científica da área uma das TOP5 propostas vacinais para a doença”, afirma.

“A principal vantagem no uso dessa tecnologia é a sua aplicabilidade”, avalia Trevisani. “Esse vetor tem como vantagem a administração por via oral sem a necessidade de seringas, agulhas ou de um profissional especializado para a administração. Permitirá uma escala de vacinação bem mais ampliada, se comparada à imunização intramuscular. Além disso, pelo fato de ser uma bactéria viva, podemos fazer uso de formulação liofilizada e utilização em locais remotos, no Brasil e no mundo, sem a necessidade de cadeia refrigerada no transporte.”

A equipe ainda não tem planos para os testes clínicos. “Tudo dependerá dos resultados obtidos nos testes de avaliação de eficácia e segurança que serão realizados em animais de experimentação”, diz Trevisani.