La molécula de crotoxina es más potente que la toxina botulínica

Esta sustancia, presente en el veneno de las serpientes de cascabel, es capaz de paralizar los músculos durante un tiempo prolongado, y también posee acción antiinflamatoria, analgésica, antitumoral e inmunomoduladora

Por Karina Toledo  |  Agência FAPESP – La crotoxina, presente en el veneno de las serpientes de cascabel (Crotalus durissus), es una molécula que ya ha mostrado potencial en experimentos de laboratorio para su uso como antiinflamatorio, analgésico, antitumoral, inmunomodulador e incluso como un paralizante muscular más potente que la toxina botulínica.

Con todo, para que este potencial terapéutico pueda convertirse en fármacos, antes resulta necesario comprender pormenorizadamente de qué manera interactúa la crotoxina con las células humanas. Investigadores brasileños dieron a conocer avances importantes en este campo de estudio en un artículo publicado en la revista Scientific Reports, perteneciente al grupo Springer Nature.

“Sugerimos un nuevo ordenamiento estructural de la molécula y también un modelo para explicar su efecto tóxico sobre el sistema nervioso. Esta información pueden ayudar a otros investigadores a diseñar compuestos sintéticos con estructuras y actividades análogas a las de las regiones de la crotoxina que despiertan interés farmacológico”, afirmó Carlos Fernandes, investigador del Instituto de Biociencias (IBB) de la Universidade Estadual Paulista (Unesp) en la ciudad de Botucatu (São Paulo, Brasil).

El trabajo se realizó durante el posdoctorado de Fernandes, con el apoyo de la FAPESP y bajo la supervisión del profesor del IBB-Unesp Marcos Roberto de Mattos Fontes.

“Se considera que la crotoxina es un heterodímero, es decir, un complejo formado por dos proteínas distintas: la CA, que no es tóxica y no tiene acción enzimática, y la CB, una fosfolipasa responsable del efecto neurotóxico”, explicó De Mattos Fontes, quien desde hace al menos una década investiga el mecanismo de acción de la molécula con el apoyo de la FAPESP.

En 2008, el grupo describió en la revista Proteins la estructura tridimensional de la proteína CB aislada.

Mediante el empleo de una técnica conocida como cristalografía por difracción de rayos X –que consiste en cristalizar a la proteína y observar de qué manera difracta ese cristal la radiación que se emite sobre él–, los investigadores de la Unesp descubrieron que, cuando no está conectada a la CA, la CB tiende a aglomerarse en grupos de cuatro, formando aquello a lo que los científicos denominan tetrámeros. Con todo, en ese ordenamiento, la proteína exhibe una menor acción neurotóxica que cuando está asociada a la CA.

Pocos años después, un grupo de Francia publicó en Journal of Molecular Biology la estructura cristalográfica del complejo formado por CA y CB. Sin embargo, algunas regiones importantes de CB quedaron escondidas por CA en el modelo cristalográfico, entre ellas las tres señaladas en la literatura científica como activas farmacológicamente: la parte N-terminal (los primeros residuos de aminoácido de la cadena), la C-terminal (los últimos residuos) y el sitio catalítico (en donde ocurre la reacción enzimática).

“Ese trabajo refutó nuestra hipótesis que indicaba que la CB aislada se organizaba en tetrámeros, lo cual generó un impasse en el medio académico”, comentó De Mattos Fontes.

El grupo de la Unesp decidió entonces investigar el ordenamiento estructural del complejo proteico en solución, es decir, en medio líquido. Esta condición se parece más a aquélla en que se encuentra a la molécula en la naturaleza.

Para ello combinaron cinco técnicas biofísicas distintas: calorimetría de titulación isotérmica, espectroscopía de fluorescencia, dicroísmo circular, dispersión dinámica de luz y dispersión de rayos X a bajo ángulo.

Este estudio contó con la colaboración de investigadores del Instituto de Física (IF) de la Universidad de São Paulo (USP), de la Facultad de Filosofía, Ciencias y Letras de Ribeirão Preto (USP), también en el estado de São Paulo, del Instituto de Ciencias Biológicas de la Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG) y de la fundación Ezequiel Dias (Funed), de Belo Horizonte (capital del estado brasileño de Minas Gerais).

“De acuerdo con los análisis calorimétricos, observamos que las moléculas de CB aisladas en un recipiente se encontraban en tetrámeros, pero a medida que íbamos inyectando CA en el medio, los tetrámeros se disociaban y las dos proteínas se unían para formar los heterodímeros”, comentó Fernandes.

Esta observación se confirmó al utilizar la dispersión dinámica de luz y la dispersión de rayos X a bajo ángulo, técnicas que permiten medir el tamaño de las moléculas, explicó De Mattos Fontes. “Al medir el diámetro, logramos confirmar que la CB aislada forma un tetrámero, la CA forma un monómero y ambas juntas, un dímero”, añadió.

En tanto, la fluorescencia, tal como explicó De Mattos Fontes, permite descubrir las partes de la molécula que se encuentran expuestas al solvente (agua, en el caso de la investigación). El análisis reveló que en la interfaz entre CA y CB se encuentran cuatro residuos del aminoácido triptofano. Dos de dichos residuos se ubican exactamente en la entrada del sitio catalítico de CB, cerrando el acceso a la región de la proteína responsable del efecto biológico. A su vez, la región N-terminal de CB queda expuesta al solvente aun cuando la proteína se encuentra unida a la CA.

“De acuerdo con la hipótesis que planteamos con base en estos análisis, dos de las regiones tóxicas de la CB quedan prácticamente bloqueadas por la CA cuando se encuentran en la forma de heterodímero. Con todo, al llegar cerca de la membrana celular, la CB logra unirse al tejido por la porción N-terminal. Esto hace que la CA se suelte del complejo, con lo cual permite que las otras zonas activas de CB –el sitio catalítico y la C-terminal– también logren unirse a la membrana, desencadenando el efecto neurotóxico”, afirmó Fernandes.

La membrana presináptica

Si bien la crotoxina es capaz de unirse a la membrana de cualquier célula del cuerpo humano, afecta especialmente a la llamada membrana presináptica, situada en la unión entre los músculos y los nervios.

De acuerdo con Cristiano Oliveira, investigador del IF-USP y coautor del artículo, se considera que esta molécula es uno de los principales agentes paralizantes del veneno de la serpiente de cascabel y ha sido estudiada en modelos animales para el tratamiento de estrabismo, debido a que tiene un efecto más duradero que el de la toxina botulínica.

“Estudios anteriores con animales indicaron que la crotoxina tiene también acción antiinflamatoria, antitumoral y analgésica. Y es posible que tenga aplicación estética. Pero faltaba descubrir de qué forma actúa. Nosotros estamos describiendo un posible mecanismo de acción, un paso importante para llegar al desarrollo de fármacos”, comentó Oliveira.

Según Fernandes, este descubrimiento también abre el camino hacia la búsqueda de compuestos capaces de inhibir la acción de la crotoxina, que serían útiles para incrementar la eficacia del soro antiofídico.

Puede leerse el artículo intitulado “Biophysical studies suggest a new structural arrangement of crotoxin and provide insights into its toxic mechanism” en el siguiente enlace: nature.com/articles/srep43885.