La regulación del ciclo de desarrollo del parásito del paludismo

En artículos publicados en Genes & Cancer y Nature Communications, se describen potenciales blancos para el desarrollo de fármacos de combate contra la enfermedad y para evitar su transmisión

Por Karina Toledo  |  Agência FAPESP – La noción de transducción de señales ha sido siempre bastante empleada por los físicos para describir la conversión de energía. Y desde hace ya algunas décadas, bioquímicos que estudian de qué manera las señales químicas –entre otras– pueden determinar lo que sucede dentro de las células utilizan ampliamente este mismo término.

Por otra parte, científicos brasileños identificaron en el Plasmodium falciparum, la especie causante de la forma más agresiva de malaria en humanos, una serie de genes cuya expresión se encuentra modulada por la hormona melatonina, producida por el organismo del huésped.

Estos resultados salieron publicados en el artículo estampado en la portada de la revista Genes & Cancer. Según los autores de esta investigación –realizada en el marco de un Proyecto Temático de la FAPESP–, algunos de estos genes constituyen potenciales blancos para el desarrollo de nuevos fármacos antipalúdicos.

“Nuestro grupo ya había demostrado en un estudio anterior que la melatonina, la hormona que regula el ciclo del sueño y la vigilia del organismo huésped, también puede tener influjo sobre el ciclo de desarrollo del parásito. Hemos estudiado –entre otras– esa vía de señalización en dicho parásito”, dijo Célia Garcia, docente del Instituto de Biociencias de la Universidad de São Paulo (IB-USP) e investigadora responsable del mencionado Proyecto Temático.

En otro trabajo, publicado en 2012 en Journal of Pineal Research, el equipo coordinado por Garcia descubrió que una cepa de P. falciparum modificada genéticamente para no producir una proteína llamada PK7 (la proteína cinasa 7) era incapaz de regular su ciclo a través de la señalización por melatonina.

“Este dato nos sugirió que la PK7 desempeña un papel importante en la transducción de señales por esta vía. Entonces empezamos a usar esa cepa transgénica en nuestras investigaciones, a los efectos de entender mejor cómo transcurre la señalización a través de la melatonina, es decir, cómo se produce el intercambio de información entre el Plasmodium y la célula humana”, dijo la investigadora.

En el marco del trabajo publicado en Genes & Cancer, el grupo investigó de qué manera el tratamiento con melatonina modifica la expresión de los genes en una cepa silvestre del parásito en comparación con la cepa que carece de PK7. El objetivo fue descubrir qué genes se encuentran bajo el control de la melatonina y, por añadidura, cuales están bajo el influjo de PK7.

Los experimentos se realizaron in vitro con hematíes humanos infectados con el P. falciparum. “En ese estadio de su ciclo de vida, el parásito causa todos los síntomas de la enfermedad, tales como fiebre alta, escalofríos y dolores en el cuerpo”, comentó Garcia.

El Plasmodium es un parásito intracelular cuyo ciclo de vida transcurre en diversos estadios, cada uno de ellos con una morfología y una bioquímica distintas. Esto es que los hace tan complejos y les permite interactuar con el organismo huésped, y sobrevivir en los más diversos ambientes.

Para analizar la expresión génica en la etapa de desarrollo del parásito conocida como trofozoíto, se empleó una técnica conocida como ARNsec, o secuenciación de ARN a gran escala.

“Esta metodología permite la identificación de pequeñas secuencias de ARN, que se compilan en un gran rompecabezas para mostrar qué genes están expresándose en un determinado estado fisiológico. Para hacerse una idea de la cantidad de datos, cada secuencia de ARN analizada tiene 100 pares de bases, y se obtienen millones de dichas secuencias. A éstas se las compara con el genoma del Plasmodium, que posee alrededor de 23 millones de pares de bases, a los efectos de identificar a qué gen corresponde cada pequeña secuencia. Cuantas más secuencias de 100 pares de bases se identifiquen para un mismo gen, más se estará expresando dicho gen”, explicó.

En los parásitos silvestres, el análisis reveló que la melatonina modificó la expresión de 38 genes. En 31 de ellos se detectó un aumento, mientras que en siete se registró una merma. En tanto, en los parásitos sin PK7 no se observaron alteraciones significativas.

Entre los genes expresados diferentemente en el parásito se encontraban el llamado SEA-1, que codifica una proteína expresada en el estadio de esquizonte en glóbulos rojos infectados.

“Ya se ha demostrado que los anticuerpos contra la proteína SEA-1 disminuyen la replicación del parásito al inhibir la ruptura de los esquizontes. También se ha observado que los parásitos genéticamente modificados para no expresar la SEA-1 exhiben defectos de replicación”, comentó Garcia.

Otro gen alterado por la melatonina fue el CAF1, el cual, según la investigadora, resulta crítico para la regulación de diversos genes durante el estadio de desarrollo que transcurre dentro de los hematíes (intraeritrocítico).

“Parásitos modificados para no expresar CAF1 sintetizan en forma errónea proteínas que toman parte en el proceso de salida e invasión de nuevas células huéspedes”, dijo Garcia.

Bloqueo del ciclo del parásito

La profesora del IB-USP también puso de relieve la existencia de genes relacionados con las proteínas (E3 ubiquitina ligasas) que integran el sistema ubiquitina-proteosoma en su carácter de posibles blancos terapéuticos. El proteosoma es un complejo encargado de barrer de las células las proteínas dañadas, y también ejecuta otras diversas funciones celulares importantes.

El siguiente paso consistió en repetir el experimento utilizando una molécula conocida como AMPc (monofosfato cíclico de adenosina), un mensajero secundario importante en la vía de señalización de la melatonina, en lugar de esta última.

En ese caso, el test se realizó en tres estadios distintos del desarrollo del parásito, que transcurren todos dentro de los hematíes: anillo, trofozoito y esquizonte. En el grupo de parásitos silvestres, la exposición al AMPc modificó la expresión de 75, 101 y 141 genes respectivamente.

“La idea de usar AMPc surgió en el marco de un trabajo que publicamos en 2005, en el cual demostramos que el parásito convierte la señal de melatonina en un aumento de ese mensajero intracelular (AMPc) y en una activación de la PKA [la proteína cinasa A]. Además del nuestro, existen varios otros trabajos donde queda evidente la importancia del AMPc en el proceso de invasión de los hematíes que realiza el parásito”, dijo Garcia.

Según la investigadora, los resultados indican que trofozoítos tratados con AMPc exhiben niveles incrementados de expresión de mARN de la proteína NEK3, que pertenece a una familia de genes que participan en la replicación del ADN.

“En el estadio de esquizonte, la AMPc promovió una mayor expresión de transcritos tales como RPA1, SEA1 y NDK, y del factor de transcripción myb2. Este grupo de genes participa en el ciclo celular y en la replicación del ADN. El aumento de la expresión de esos genes en las formas más maduras como el trofozoíto y esquizonte justificaría el porqué de que el ciclo del parásito se acelere cuando se lo trata con AMPc”, dijo Garcia.

Según la investigadora, aumentó el nivel de expresión también de diversos genes que participan en vías metabólicas, por ello constituyen potenciales blancos apuntando a bloquear el ciclo del parásito en los glóbulos rojos de la sangre.

“Cada uno de esos genes descritos en el trabajo toma parte en actividades metabólicas y fisiológicas. En términos académicos, estos resultados pueden ayudarnos a entender mejor la biología básica del parásito: cómo regula su ciclo de vida y cómo logra desarrollarse en determinadas circunstancias. Asimismo, algunos de esos blancos podrán investigarse en el futuro como auxiliares de fármacos que desregulan el ciclo del parásito y facilitan la acción del sistema de defensa humano”, afirmó Garcia.

Puede leerse el artículo intitulado Signaling transcript profile of the asexual intraerythrocytic development cycle of Plasmodium falciparum induced by melatonin and cAMP, publicado en Genes & Cancer, en el siguiente enlace: impactjournals.com/Genes&Cancer/index.php?pii=118. 

Nuevos blancos contra el paludismo

Luego de la fase hepática, se liberan miles de merozoítos –el merozoito es otro estadio del desarrollo del Plasmodium– en el torrente sanguíneo, lo cual da inicio a la etapa asexuada del ciclo del paludismo: la invasión de los eritrocitos y el ciclo intraeritrocítico, con el desarrollo de estadios de maduración claramente definidos: anillo, trofozoíto y esquizonte.

Mediante un mecanismo desconocido, la célula huésped se rompe y se liberan los merozoítos en el torrente sanguíneo: estos invaden nuevamente los eritrocitos y recomienzan un nuevo ciclo. Algunos merozoítos invasores de los eritrocitos se diferencian en gametocitos femeninos y masculinos, que forman gametos cuando los insectos los ingieren, dando inicio así a la fase sexuada.

“La fecundación de esos gametos da origen a un oocineto móvil, que se aloja en el intestino medio del insecto y sufre divisiones para formar esporozoítos. Los esporozoítos migran hacia las glándulas salivales del mosquito, en donde serán liberados durante la alimentación del insecto”, explicó Garcia.

Para que los esporozoítos se desplacen hasta las glándulas salivales y puedan pasar entonces a un huésped humano, la cápsula que envuelve a los oocistos debe romperse.

En un estudio realizado por Garcia junto a científicos de Grecia e Italia, cuyos resultados salieron publicados en Nature Communications el pasado 16 de diciembre, el grupo identificó dos proteínas presentes en la cápsula de los oocistos al momento de la ruptura.

Los científicos también observaron que en oocistos sin ambas proteínas, a las cuales denominaron ORP1 y ORP2, la ruptura no se concretó. La proteína ORP1 está presente en la cápsula de los oocistos desde su estadio inicial, en tanto que la OPR2 deriva del citoplasma de la cápsula cuando se forman los esporozoítos maduros.

Ambas proteínas surgen como nuevos blancos con miras a interrumpir la transmisión del parásito a través de los mosquitos.

“Este estudio tuvo su origen luego de que nuestro grupo detectara que el factor de transcripción PfNFYB, bien estudiado en células de mamíferos, aparece expresado en los distintos estadios del ciclo intraeritrocítico y se ubica junto a la región nuclear en las etapas tardías del ciclo, cuando podría ejercer la función de factor de transcripción y regular la expresión génica o interactuar con otras proteínas”, dijo Garcia. Los primeros resultados salieron publicados en 2013 en Journal of Pineal Research.

Con el objetivo de entender la función del NFYB en el ciclo sexual que transcurre en el mosquito, los trabajos con esta proteína se enfocaron en los estadios de desarrollo del parásito en el insecto, denominados ooquineto, oocisto y esporozoítos. La forma esporozoíta se desarrolla dentro del oocisto, y esporozoítos maduros viajan hasta la glándula salival del mosquito; desde allí pasan al huésped en el momento en que el insecto pica.

“En P. berghei, la proteína fue denominada ORP1 (proteína de ruptura del oocisto), pues se localiza en la cápsula del oocisto. El KO (“nocaut”) del gen que codifica la expresión de estas proteínas (ORP1) presenta un bloqueo en la ruptura del oocisto. Y el oocisto es una forma del parásito cuya parte de la membrana viene del epitelio del intestino y la parte material es sintetizada por el parásito”, explicó Garcia.

Según la investigadora, experimentos tendientes a verificar la presencia de los esporozoítos en el oocisto mostraron que parásitos WT (“wild type”) no poseen esporozoítos al día 12 o al día 20 (luego de la infección), pues ya han migrado hacia la glándula salival.

“Sin embargo, los parásitos KO aún poseen varios esporozoítos en el intestino. En el estadio sexual, la NFYB (ORP) tiene una función no relacionada con la unión de ADN y no se encuentra en el núcleo, aunque tiene dominios conservados de NFYB y NFYC”, dijo.

Los investigadores también caracterizaron una segunda proteína orp2, que se encuentra en el citoplasma y migra a la cápsula del oocisto cuando se forma el esporozoíto maduro. Tanto el KO de la ORP1 como el de la ORP2 llevan a la falta de la ruptura del oocisto.

“La identificación de la OPR1 y de la ORP2 como proteínas esenciales para la transmisión de la malaria a través de las picaduras de mosquitos ofrece una nueva comprensión referente a aspectos de la transmisión de esporozoítos en dichas picaduras, y sugiere que intervenciones que tengan como blancos componentes del oocisto podrían erigirse en herramientas eficientes para el bloqueo de la transmisión”, destacan en el artículo.

“Creemos que la comprensión de la base de la señalización de los procesos celulares de los diversos estadios de vida del parásito nos ayudará a identificar nuevos blancos. Este estudio muestra la importancia de entender la función de ciertas proteínas en el parásito del paludismo: ha quedado demostrado que la misma es distinta en las etapas de vida que transcurren dentro de los hematíes y en los mosquitos”, dijo Garcia.

Puede leerse el artículo intitulado Release of Plasmodium sporozoites requires proteins with histone fold dimerization domains (10.1038/NCOMMS13846), publicado en Nature Communications, en el siguiente enlace nature.com/articles/ncomms13846.