Nanocápsulas extraen de la circulación las partículas más nocivas del colesterol

En pruebas con ratones, esta estrategia terapéutica hace que disminuya un 74% la formación de lesiones ateroscleróticas y un 88% la liberación de moléculas inflamatorias

Por Karina Toledo  |  Agência FAPESP – Científicos de la Universidad de São Paulo (USP), en Brasil, están probando en ratones una nanofórmula capaz de extraer de la circulación sanguínea las partículas más nocivas del llamado “colesterol malo”: la lipoproteína de baja densidad electronegativa (LDL-, por sus siglas en inglés).

Este estudio se lleva adelante en la Facultad de Ciencias Farmacéuticas (FCF-USP) de dicha universidad, en el marco de un Proyecto Temático de la FAPESP, del cual Dulcineia Saes Parra Abdalla es la investigadora principal. Resultados recientes salieron publicados en European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics.

“Nuestra propuesta consiste en crear un sistema destinado a la remoción de esa LDL- de la circulación, de manera tal de impedir que esas partículas interactúen con las paredes de las arterias e induzcan una respuesta proinflamatoria que contribuya para iniciar y hacer que progresen las lesiones ateroscleróticas”, comentó Saes Parra Abdalla en declaraciones a Agência FAPESP.

De acuerdo con la investigadora, aunque toda la fracción de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) carga la fama de ser “colesterol malo”, la subfracción electronegativa (LDL-) –en la que se incluyen partículas modificadas mediante procesos químicos tales como oxidación y lipólisis– puede considerarse como la más aterogénica y, por tal motivo, la principal amenaza contra la salud cardiovascular.

Al ser reconocida e incorporada por los macrófagos –células del sistema inmunológico–, la LDL- desencadena una respuesta inflamatoria que aumenta la inestabilidad de la placa aterosclerótica y contribuye así en la ruptura del ateroma de la pared de la arteria. Este proceso puede culminar en un evento cardiovascular: un infarto agudo de miocardio o un accidente cerebrovascular.

“Al incorporar esos lípidos modificados, los macrófagos se transforman en las llamadas células espumosas. La acumulación de células espumosas representa el comienzo de las lesiones ateroscleróticas. Cuando esos macrófagos mueren, liberan todo su contenido de lípidos y otros fragmentos celulares y forman una región necrótica en la pared de la arteria. Ésta atrae a otros macrófagos hacia la zona, y lo propio sucede con los linfocitos y otros tipos de células de defensa, que pasan entonces a liberar más moléculas inflamatorias y a agravar el cuadro”, explicó Saes Parra Abdalla.

Inicialmente, según comentó la investigadora, el objetivo del grupo consistió en crear una metodología destinada a detectar la subpoblación de partículas LDL- en pacientes con dislipidemias, diabetes, insuficiencia renal crónica y otras afecciones asociadas a riesgo cardiovascular. Cabe recordar que en los análisis convencionales realizados en laboratorios se miden las lipoproteínas de baja densidad en general, sin discriminar esa subfracción que es más aterogénica.

“Desarrollamos anticuerpos monoclonales capaces de detectar y unirse únicamente a las partículas LDL- con fines diagnósticos. Pero después pensamos que podríamos aprovechar esa herramienta en un abordaje terapéutico, es decir, usar esos anticuerpos para neutralizar las partículas aterogénicas”, comentó Saes Parra Abdalla.

Para delinear la estrategia

En los estudios en marcha se emplea un modelo experimental de aterosclerosis. Se modificaron ratones genéticamente para que expresen el gen de la proteína que actúa como receptor para las lipoproteínas de la clase LDL. De esta forma, el “colesterol malo” se acumula en la circulación de los animales simulando casos de hipercolesterolemia familiar. Esta acumulación lleva al desarrollo de lesiones ateroscleróticas, en el caso de los ratones fundamentalmente en la zona del arco aórtico (la parte de la arteria aorta que se ubica dentro del corazón). Con menos de dos meses de dieta rica en colesterol, esos roedores desarrollan aterosclerosis.

Inicialmente, el grupo de la FCF-USP probó el tratamiento con el anticuerpo monoclonal entero. Con todo, al unirse al antígeno (las partículas LDL-), el inmuncomplejo formado podría ser incorporado por los macrófagos, lo cual haría aumentar más aún la formación de células espumosas y exacerbaría la respuesta inflamatoria.

“Fue entonces cuando pensamos en cortar una parte del anticuerpo y trabajar solamente con los fragmentos capaces de reconocer al antígeno. De este modo, la porción del anticuerpo que se enlaza a los receptores de los macrófagos –llamada Fe– sería eliminada”, comentó Saes Parra Abdalla.

Mediante ingeniería genética, en colaboración con la investigadora Andrea Queiroz Maranhão, de la Universidad de Brasilia (UnB), el grupo desarrolló un método para expresar en levaduras de la especie Pichia pastoris una proteína recombinante formada por las regiones hipervariables de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo que reconocen a la LDL-, que fueron unidas por un péptido conector. Los investigadores denominan a esa proteína scFv (fragmento variable de cadena única, por sus siglas en inglés). Esa parte del trabajo se desarrolló durante la maestría de Soraya Megumi Kazuma, con Beca de la FAPESP.

“El problema consiste en que el scFv es una molécula pequeña, con un bajo tiempo medio de vida en la circulación sanguínea si se lo compara con el del anticuerpo monoclonal completo. Por eso nuestra estrategia consiste en incorporar el scFv a una nanocápsula, para aumentar su tiempo de vida en la circulación y permitir, en el futuro, la liberación de fármacos en el ateroma de manera dirigida”, reveló la investigadora.

Esta parte del trabajo contó con la colaboración de Adriana Raffin Pohlmann y Silvia S. Guterres, ambas de la Universidad Federal de Rio Grande do Sul (UFRGS). Los investigadores han depositado dos patentes referentes a la nanofórmula en el Instituto Nacional de la Propiedad Industrial (INPI).

De acuerdo con Saes Parra Abdalla, la nanofórmula contiene nanocápsulas poliméricas de múltiples capas, es decir, existe un núcleo lipídico donde es posible ubicar fármacos liposolubles, recubierto por múltiples estratos en los cuales es posible agregar otros fármacos o moléculas a los efectos de orientar al fármaco hacia el blanco terapéutico.

“Nuestra estrategia consistió en poner el scFv sobre la superficie de la nanopartícula para orientarla hacia la LDL- presente en la circulación. De esta forma, la LDL- unida a la nanofórmula no sería incorporada por los macrófagos, y el scFv tampoco se uniría a esas células por la vía de receptores Fe, que serían utilizados por el anticuerpo completo. Esto reduciría el proceso de acumulación de colesterol proveniente de la lipoproteína modificada por el macrófago y, por consiguiente, disminuiría la formación de células espumosas y la liberación de mediadores proinflamatorios en la pared arterial, explicó la investigadora.

La prueba de concepto

En el modelo experimental, los investigadores pusieron a prueba un protocolo de prevención de la aterosclerosis con la nanofórmula. Este trabajo se llevó a cabo durante el doctorado de Marcela Frota Cavalcante, becaria de la FAPESP. Se les inyectó una dosis a los ratones siete días antes de dar inicio a su alimentación rica en colesterol. En el transcurso de 28 días de dieta con un 0,5% de colesterol, se les aplicaron otras cuatro dosis. Al cabo de dicho período, se realizó un estudio histológico de la región del arco aórtico.

En comparación con los animales del grupo de control –a los cuales en lugar de la nanofórmula se les administró únicamente un placebo–, en los ratones tratados aparecía un área con una lesión aterosclerótica un 74% menor. También se observó en el tejido una cantidad un 68% menor de interleucina-1 beta (IL-1β), la citocina proinflamatoria que liberan los macrófagos.

“La liberación de esa citocina IL-1β entre otras constituye un factor importante para el aumento de la actividad inflamatoria de la placa aterosclerótica, y esto es más problemático que el tamaño de la lesión en sí, pues aumenta el riesgo de ruptura del ateroma y de formación de trombos. Por eso en la actualidad la principal estrategia terapéutica consiste en combatir la inflamación en las placas ateroscleróticas”, explicó Saes Parra Abdalla.

Según la investigadora, la nanofórmula actúa en dos frentes: retira de la circulación un estímulo proinflamatorio –la lipoproteína modificada– y minimiza la acumulación de lípidos en los vasos sanguíneos. Por ende, disminuye tanto el tamaño de la lesión como la actividad inflamatoria en la placa.

Actualmente el grupo está realizando estudios con ratones con la intención de verificar cuánto tiempo permanece la nanofórmula en el organismo antes de ser metabolizada y hacia dónde ésta orienta a las partículas LDL-. Para ello, se están empleando técnicas de imágenes moleculares tales como tomografía por emisión de positrones y tomografía computarizada. Este trabajo cuenta con la colaboración de científicos del Instituto de Investigaciones Energéticas y Nucleares (Ipen). Los resultados se darán a conocer en breve.

Puede leerse el artículo intitulado A nanoformulation containing a scFv reactive to electronegative LDL inhibits atherosclerosis in LDL receptor knockout mice (doi: 10.1016/j.ejpb.2016.07.002) en el siguiente enlace: sciencedirect.com/science/article/pii/S0939641116302612.