Revelan el blanco principal del SARS-CoV-2 en el cerebro y los efectos del virus en el sistema nervioso

En el marco de una investigación a cargo de científicos de las universidades de São Paulo y de Campinas, en Brasil, se combinaron imágenes de resonancia tomadas en pacientes que tuvieron la forma leve del COVID-19, análisis de tejidos cerebrales de personas que fallecieron como consecuencia de la infección y experimentos con células nerviosas humanas infectadas en laboratorio

Por Karina Toledo  |  Agência FAPESP – Un estudio brasileño publicado en la revista PNAS describe algunos de los efectos que puede provocar la infección causada por el SARS-CoV-2 en el sistema nervioso central. El referido trabajo, cuya versión preliminar (sin revisión por pares) se dio a conocer en el año 2020, fue uno de los primeros en demostrar que el virus del COVID-19 es capaz de infectar a las células del tejido cerebral, y que su blanco principal lo constituyen los astrocitos. Y también fue pionero al describir alteraciones en la estructura de la corteza cerebral, la zona del cerebro más rica en neuronas, en pacientes que tuvieron la forma leve de la enfermedad.

Esta investigación estuvo a cargo de diversos grupos de científicos de la Universidad de Campinas (Unicamp) y de la Universidad de São Paulo (USP), todos financiados por la FAPESP, que contaron también con la colaboraron de pares del Laboratorio Nacional de Biociencias (LNBio), del Instituto D'Or de Pesquisa e Ensino (IDOR) y de la Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ).

“Nosotros demostramos por primera vez que el virus efectivamente infecta a los astrocitos y se replica en ellos, y que esto puede hacer mermar la viabilidad de las neuronas”, le comenta a Agência FAPESP Daniel Martins-de-Souza, docente del Instituto de Biología (IB) de la Unicamp, investigador del IDOR y uno de los coordinadores de la investigación.

Los astrocitos son las células más abundantes del sistema nervioso central y cumplen diversas funciones: les suministran sostén y nutrientes a las neuronas, regulan la concentración de neurotransmisores y otras sustancias con potencial para interferir en el funcionamiento neuronal, como el potasio, integran la barrera hematoencefálica, que ayuda a proteger el cerebro contra patógenos y toxinas, y ayudan a mantener la homeostasis cerebral.

La infección de este tipo de células se confirmó mediante la realización de experimentos con tejidos cerebrales de 26 pacientes que murieron de COVID-19. Las muestras se extrajeron durante procedimientos de autopsias mínimamente invasivas a cargo del patólogo Alexandre Fabro, docente de la Facultad de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP-USP). Los análisis estuvieron coordinados por Thiago Cunha, docente de la FMRP-USP e integrante del Centro de Investigaciones en Enfermedades Inflamatorias (CRID).

Los investigadores adoptaron una técnica conocida como inmunohistoquímica, que consiste en utilizar anticuerpos para marcar antígenos virales o componentes del tejido analizado, tal como lo explica Martins-de-Souza. “Podemos poner en la muestra anticuerpos que al unirse a los astrocitos hacen que las células adquieran una coloración roja, por ejemplo; y otros que al conectarse con la proteína de las espículas del SARS-CoV-2 marca a las moléculas en verde; y, por último, podemos poner anticuerpos para marcar en color púrpura al ARN viral de cadena doble, que solamente aparece durante el proceso de replicación del microorganismo. Cuando se superpusieron todas las imágenes tomadas durante el experimento, notamos que los tres colores aparecen simultáneamente tan solo dentro de los astrocitos.”

De acuerdo con Cunha, la presencia del virus se confirmó en cinco de las 26 muestras estudiadas. Y en esos cinco casos también se detectaron alteraciones que sugerían un posible perjuicio del sistema nervioso central.

“Observamos en esos cinco casos señales de necrosis y de inflamación, tales como edema [la hinchazón causada por acumulación de líquido], lesiones neuronales e infiltración de células inflamatorias”, comenta Cunha.

También en la USP de Ribeirão Preto se confirmó la capacidad del SARS-CoV-2 para infectar el tejido cerebral y su preferencia por los astrocitos, en un trabajo a cargo del grupo del profesor Adriano Sebolella en un modelo experimental de “rodajas cerebrales”. Esta técnica consiste en cultivar in vitro e infectar con el virus muestras de tejido cerebral humano obtenidas durante cirugías destinadas a tratar enfermedades neurológicas: la epilepsia refractaria a medicamentos, por ejemplo.

Síntomas persistentes

En otro brazo de la investigación, en la Facultad de Ciencias Médicas (FCM) de la Unicamp, se les realizaron exámenes de resonancia magnética a 81 voluntarios que contrajeron la forma leve de COVID-19 y se recuperaron. Las evaluaciones presenciales se concretaron en promedio 60 días después de la fecha del test de diagnóstico y una tercera parte de los participantes aún exhibían síntomas neurológicos o neuropsiquiátricos. Las principales quejas fueron dolor de cabeza (40 %), fatiga (40 %), alteraciones de la memoria (30 %), ansiedad (28 %), pérdida del olfato (28 %), depresión (20 %), somnolencia diurna (25 %), pérdida del gusto (16 %) y disminución de la libido (14 %).

“Dimos a conocer un enlace para que los interesados en participar en la investigación pudieran inscribirse y, para nuestro asombro, en pocos días ya contábamos más de 200 voluntarios, muchos de ellos polisintomáticos y con quejas variadas. Aparte de los exámenes de neuroimágenes, se los evaluó mediante exámenes neurológicos y test estandarizados a los efectos de medir sus desempeños en funciones cognitivas tales como la memoria, la atención y la flexibilidad de razonamiento. En el artículo mostramos los primeros resultados”, comentó la profesora Clarissa Yasuda, del Instituto de Investigaciones sobre Neurociencias y Neurotecnología (BRAINN).

En la investigación se incluyó únicamente a personas con diagnóstico de COVID-19 confirmado mediante análisis de RT-PCR y que no tuvieron que hospitalizarse. Las evaluaciones se realizaron luego de la fase aguda y los resultados se compararon con datos de 145 individuos sanos y no infectados.

Mediante el análisis de los estudios de resonancia magnética fue posible detectar algunas áreas de la corteza cerebral de los voluntarios con un espesor menor que el promedio que se registró en los individuos de control, mientras que otras exhibían un aumento de tamaño, cosa que, según los autores, podría indicar algún grado de edema.

“Observamos atrofia en áreas relacionadas con la ansiedad, uno de los síntomas más frecuentes en el grupo estudiado. Considerando que la prevalencia promedio de trastornos de ansiedad en la población brasileña es del 9 %, el 28 % que registramos constituye un porcentaje elevado y alarmante. No esperábamos estos resultados en pacientes que tuvieron la enfermedad leve”, afirma Yasuda.

En los test neuropsicológicos –realizados con el objetivo de evaluar las funciones cognitivas– los voluntarios del estudio también obtuvieron resultados ubicados por debajo del promedio de los brasileños en algunas tareas. Los resultados se ajustaron de acuerdo con la edad, el sexo y la escolaridad de cada participante. También se tuvo en cuenta el grado de fatiga informado por cada participante a los investigadores.

“La pregunta que subsiste es: ¿estos síntomas son pasajeros o permanentes? Hasta el presente hemos observado que algunas personas mejoran, pero desafortunadamente varias permanecen con alteraciones. Algo que nos ha sorprendido es que muchas se reinfectaron con nuevas variantes y algunas experimentaron un empeoramiento de los síntomas que padecían desde la primera infección. Frente a este nuevo virus, entendemos que el seguimiento longitudinal resulta crucial para entender la evolución de las alteraciones neuropsiquiátricas en el transcurso del tiempo, a los efectos de desarrollar blancos terapéuticos específicos”, afirma Yasuda.

El metabolismo energético queda afectado

En el Laboratorio de Neuroproteómica del IB-Unicamp, coordinado por Martins-de-Souza, se realizaron diversos experimentos con tejidos cerebrales de personas que murieron de COVID-19 y con cultivos de astrocitos in vitro para descubrir, desde el punto de vista bioquímico, de qué manera afecta a las células del sistema nervioso la infección provocada por el SARS-CoV-2.

Las muestras de necropsias se obtuvieron en el marco de una colaboración con el grupo del profesor de la Facultad de Medicina de la USP Paulo Saldiva. El conjunto de proteínas (el proteoma) presente en los tejidos se mapeó mediante espectrometría de masas, una técnica que permite discriminar sustancias en muestras biológicas de acuerdo con su masa molecular.

“Al comparar con los resultados de individuos no infectados, nos percatamos de que diversas proteínas cuya expresión aparecía alterada son abundantes en los astrocitos, lo cual valida los hallazgos obtenidos mediante inmunohistoquímica”, dice Martins-de-Souza. “En esas células, observamos alteraciones en diversas vías bioquímicas, fundamentalmente en aquellas relacionadas con el metabolismo energético”, comenta el investigador.

El paso siguiente consistió en repetir el análisis proteómico en un cultivo de astrocitos infectado en laboratorio. Las células se obtuvieron a partir de células madre pluripotentes inducidas (IPS, por sus siglas en inglés), un método que consiste en reprogramar células adultas (provenientes de la piel o de otro tejido de fácil acceso) para hacerlas asumir un estadio de pluripotencia similar al de las células madre embrionarias. Esta primera parte se realizó en el laboratorio del profesor de la UFRJ Stevens Rehen, en el IDOR. Posteriormente, el equipo de Martins-de-Souza indujo a las células IPS mediante estímulos químicos a diferenciarse en células madre neurales, y después en astrocitos.

“Los resultados fueron parecidos a los de los análisis realizados en los tejidos obtenidos mediante necropsia, es decir, indicaron una disfunción en el metabolismo energético. Efectuamos entonces un análisis metabolómico [del conjunto de los metabolitos que producen los astrocitos en cultivo], que indicó una alteración en el metabolismo de la glucosa. Por algún motivo, los astrocitos infectados pasan a consumir más glucosa que lo normal y, pese a ello, los niveles de piruvato y de lactato –los dos principales sustratos energéticos– aparecen bastante disminuidos en las células”, comenta.

Tal como lo explica el investigador, el lactato es uno de los subproductos del metabolismo de la glucosa y los astrocitos exportan ese metabolito a las neuronas, que lo utiliza como fuente de energía. Los análisis in vitro demostraron que la cantidad de lactato existente en el medio de cultivo de las células era normal, aunque aparecía reducida en su interior. “Aparentemente, los astrocitos se esfuerzan por mantener el suministro del sustrato energético hacia las neuronas en detrimento de su propio funcionamiento”, comenta Martins-de-Souza.

Como resultado de este proceso, las mitocondrias de los astrocitos –los orgánulos encargados de la producción de energía– pasaron a funcionar en forma alterada, lo cual puede influir en los niveles cerebrales de neurotransmisores tales como el glutamato (que excita a las neuronas y que está relacionado con la memoria y el aprendizaje) y el ácido gamma-aminobutírico (GABA, con capacidad para inhibir el disparo neuronal excesivo y promover una sensación de calma y relajación).

“En otro experimento, intentamos cultivar neuronas en ese medio donde antes estaban cultivándose los astrocitos infectados y observamos que las células mueren más que lo esperable. Es decir que ese medio de cultivo ‘condicionado por los astrocitos infectados’ disminuyó la viabilidad de las neuronas”, comentó Martins-de-Souza.

Los hallazgos descritos en el artículo van al encuentro de diversos trabajos ya publicados, que apuntaron posibles manifestaciones neurológicas y neuropsiquiátricas del COVID-19.

Los resultados de experimentos con hámsteres realizados en el Instituto de Biociencias de la USP, por ejemplo, reforzaron la hipótesis que indica que la infección provocada por el SARS-CoV-2 acelera el metabolismo de los astrocitos e incrementa el consumo de moléculas utilizadas en la generación de energía, tales como las de glucosa y del aminoácido glutamina. Y los resultados obtenidos por el equipo coordinado por Jean Pierre Peron indican que esta alteración metabólica perjudica la síntesis de un neurotransmisor importante para la comunicación entre neuronas (lea más en: agencia.fapesp.br/37398/).

Los interrogantes que permanecen

Según Martins-de-Souza, aún no existe un consenso en la literatura científica acerca del camino por el cual el SARS-CoV-2 llega al cerebro. “Algunos experimentos con animales sugieren que el virus puede atravesar la barrera hematoencefálica. También se sospecha que infecta el nervio olfativo y así sube al sistema nervioso central, pero son solamente hipótesis, por ahora”, dice el científico.

Una de las cosas que el artículo que ahora ha salido publicado en PNAS reveló es que, en el sistema nervioso central, el virus no se vale de la proteína ACE-2 para ingresar en las células, tal como lo hace en los pulmones. “Los astrocitos no poseen esa proteína en su membrana. Trabajos a cargo del equipo del profesor Flávio Veras [FMRP-USP] demostraron que, en este caso, el SARS-CoV-2 se une a la proteína neuropilina. Esto muestra su versatilidad para infectar distintos tipos de tejidos”, comenta Martins-de-Souza.

En el Laboratorio de Neuroproteómica de la Unicamp, Martins-de-Souza realizó análisis proteómicos en células nerviosas y también de otros tejidos afectados por el COVID-19, tales como los de adipocitos y de células inmunitarias y gastrointestinales. El objetivo de ello consistió en ver de qué manera la infección alteraba el proteoma, es decir, el conjunto de proteínas expresadas en esas células.

“Actualmente estamos compilando los datos para ver las peculiaridades y las diferencias de las alteraciones causadas por el virus en esos distintos tejidos humanos. Miles de proteínas y centenas de vías bioquímicas pueden estar alteradas y variar en cada caso. Este conocimiento puede orientar la búsqueda de tratamientos específicos para cada sistema perjudicado por el COVID-19”, afirma Martins-de-Souza.

“También estamos comparando las diferencias proteómicas detectadas en el tejido cerebral de quienes murieron a causa del COVID-19 con diferencias proteómicas que hemos observado en el transcurso de los años en pacientes con esquizofrenia. Existe una correspondencia de síntomas en esas dos condiciones. Las psicosis, que constituyen los signos más clásicos de la esquizofrenia, también aparecen en personas con COVID-19”, informa.

El objetivo del estudio es descubrir si la infección provocada por el SARS-CoV-2 puede derivar en la degeneración de la materia blanca del cerebro, compuesta fundamentalmente por células de la glía (astrocios y microglías) y por axones (prolongaciones de las neuronas). “Hemos detectado una gran correspondencia [en el patrón de alteraciones proteómicas] asociada al metabolismo energético y a proteínas de la glía que parecen ser importantes tanto en el caso del COVID-19 como en la esquizofrenia. Puede que estos hallazgos acorten el camino hacia el diseño de tratamientos contra los síntomas psiquiátricos del COVID”, sostiene Martins-de-Souza.

Marcelo Mori, docente del IB-Unicamp e integrante del Centro de Investigaciones en Obesidad y Comorbilidades (OCRC), destaca que esta investigación solamente fue posible merced a la colaboración de investigadores con formaciones y capacidades variadas y complementarias. “Este es un ejemplo de que para hacer ciencia de calidad y competitiva es necesario aunar esfuerzos interdisciplinarios. Es difícil competir internacionalmente si nos quedamos dentro de nuestros laboratorios únicamente, ceñidos a las técnicas que conocemos y a los equipos y aparatos a los que tenemos acceso”, afirma.

El artículo cuenta con un total de 74 autores, y los experimentos estuvieron a cargo de tres posdoctorandos: Fernanda Crunfli, Victor C. Carregari y Veras.

Tanto el OCRC como el CRID y el BRAINN son Centros de Investigación, Innovación y Difusión (CEPID) financiados por la FAPESP. El apoyo de la Fundación también se concretó en el marco de otros siete proyectos: 20/04746-0, 17/25588-1, 19/00098-7, 20/04919-2, 20/05601-6, 20/04860-8 y 19/11457-8.

Puede leerse el artículo intitulado Morphological, cellular, and molecular basis of brain infection in COVID-19 patients en el siguiente enlace: www.pnas.org/doi/abs/10.1073/pnas.2200960119?af=R.