Una enzima ayuda a ciertas bacterias a defenderse contra sustancias oxidantes

En el marco de una investigación publicada en PNAS, científicos identificaron sustratos biológicos de la enzima bacteriana Ohr, un potencial blanco para el desarrollo de nuevos fármacos

Por Karina Toledo  |  Agência FAPESP – Una investigación que contó con el apoyo de la FAPESP y se realizó en la Universidad de São Paulo (USP), Brasil, en colaboración con otras instituciones de investigación nacionales e internacionales, reveló nuevos aspectos relacionados con el mecanismo de acción de la enzima Ohr (proteína de resistencia a hidroperóxidos orgánicos, por sus siglas en inglés), que dota a diversas especies de bacterias de la capacidad de neutralizar sustancias oxidantes liberadas por el sistema de defensa del organismo huésped, ya sea una planta o un animal.

Estos resultados se dieron a conocer recientemente en la revista Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS). Según los autores, el conocimiento al respecto puede permitir nuevos abordajes terapéuticos.

“No existe en las plantas o en los animales ninguna proteína conocida con una estructura similar a la de la Ohr. Esto sugiere que es posible inhibir esta enzima en la bacteria sin causarle grandes perjuicios al organismo infectado. Por eso la misma constituye un blanco interesante para el desarrollo de fármacos”, afirmó Luis Eduardo Soares Netto, docente del Instituto de Biociencias (IB-USP) y coordinador del estudio.

Sin embargo, el investigador hizo hincapié en que aún faltan datos que relacionen la presencia de la Ohr con la virulencia de los patógenos.

El equipo de Soares Netto llevó a cabo diversos experimentos a los efectos de entender de qué manera participa la Ohr en la defensa antioxidante de las bacterias, muchas de ellas patogénicas. Una parte de la investigación se concretó durante la maestría de Thiago Alegria, el doctorado de José Renato Cussiol y el posdoctorado de Diogo Meireles, todos becarios de la FAPESP. Los proyectos están vinculados al Centro de Investigación en Procesos Redox en Biomedicina (Redoxoma), uno de los Centros de Investigación, Innovación y Difusión (CEPIDs) que cuentan con el apoyo de la FAPESP.

“Cuando empezamos la investigación sabíamos que la Ohr tenía una función antioxidante, pero no se conocían los sustratos fisiológicos de esta enzima. En este estudio demostramos que la misma neutraliza preferentemente peróxidos –particularmente los hidroperóxidos de ácidos grasos de cadena larga– y el peroxinitrito”, comentó Soares Netto.

Para arribar a esta conclusión, los investigadores realizaron inicialmente las llamadas pruebas de acoplamiento molecular (docking). Mediante simulaciones computacionales, fue posible ver el encastre de los posibles sustratos en el sitio activo de la enzima. Estos análisis mostraron una gran complementariedad estructural entre la Ohr y distintos tipos de hidroperóxidos de ácidos grasos, tales como los derivados del ácido araquidónico y del ácido linoleico, sustancias que actúan como mediadores de procesos inflamatorios en mamíferos y en plantas, respectivamente.

Para validar este primer hallazgo, se realizaron ensayos bioquímicos in vitro con la proteína Ohr producida por la Xylella fastidiosa, la bacteria causante de la enfermedad denominada clorosis variegada de los cítricos (CVC), conocida como “amarelinho” en Brasil, que ataca a las plantaciones de cítricos. De acuerdo con la explicación Soares Netto, este trabajo constituye un despliegue del proyecto realizado durante la década 1990 con el apoyo de la FAPESP para secuenciar el genoma de la X. fastidiosa.

En las pruebas in vitro, los científicos incubaron Ohr purificada con diversos tipos de hidroperóxidos. El objetivo consistió en medir el tiempo necesario para que la enzima transforme cada uno de esos oxidantes en sustancias menos tóxicas.

“Observamos que la misma logra neutralizar el peróxido de hidrógeno [agua oxigenada], por ejemplo, pero el proceso es 100 mil veces más lento que en el caso del hidroperóxido de ácido araquidónico”, comentó Soares Netto.

Según el investigador, la reacción química ocurrió a una escala de milisegundos cuando se incubó la enzima con los hidroperóxidos de ácidos grasos. En tanto, con otros tipos de hidroperóxidos, el proceso transcurrió en minutos.

Una sorpresa para el grupo en esa etapa fue observar que, en contacto con el peroxinitrito, la enzima actuaba con la misma eficiencia que se observó con los hidroperóxidos de ácido araquidónico y ácido linoleico, algo que no estaba previsto en las simulaciones computacionales.

“El peroxinitrito es un producto formado por otros dos radicales: el superóxido y el óxido nítrico. Es liberado tanto por plantas como por mamíferos en respuesta a la infección por patógenos”, explicó el investigador.

Inhibición del crecimiento

El paso siguiente fue la realización de ensayos microbiológicos. Para concretarlos, el grupo del IB-USP empleó linajes de bacterias de la especie Pseudomonas aeruginosa, que en humanos suele causar infecciones oportunistas en el sistema respiratorio, por ejemplo.

“Comparamos un grupo de bacterias mutantes en las cuales se borró el gen de la Ohr con bacterias silvestres [capaces de elaborar la enzima]. Ambos grupos quedaron dispuestos en diferentes concentraciones de hidroperóxidos para testear su resistencia”, comentó Soares Netto.

Mientras que las bacterias silvestres lograron crecer incluso a altas concentraciones de hidroperóxidos, los linajes mutantes dejaban de multiplicarse aun con las dosis más bajas. Con todo, cuando se insertó el gen de la Ohr nuevamente en el linaje mutante, esas bacterias volvieron a mostrar resistencia a los oxidantes a un nivel comparable con el de las células silvestres.

Según la explicación de Soares Netto, en el transcurso del proceso evolutivo las bacterias desarrollaron un gran repertorio de proteínas antioxidantes para enfrentarse a las defensas de los organismos huéspedes; y entre dichas proteínas cobran relieve las enzimas peroxirredoxinas y catalasas.

Las pruebas realizadas en la USP demostraron que otras bacterias mutantes, con la deleción de esas otras enzimas antioxidantes, no presentaron la misma sensibilidad a los hidroperóxidos de ácidos grasos y al peroxinitrito que se observó en el linaje mutante sin Ohr. A juicio de Soares Netto, este dato sugiere que la Ohr desempeña un papel central en la defensa antioxidante bacteriana.

La peroxirredoxina

En otro trabajo, publicado en la revista Scientific Reports, el grupo de Soares Netto, en colaboración con el grupo del profesor Marcos Antonio de Oliveira, de la Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus Experimental del Litoral Paulista (São Paulo, Brasil), estudió otra enzima antioxidante: la peroxirredoxina.

Estas proteínas son capaces de neutralizar muy rápidamente al peróxido de hidrógeno. Por ser muy abundantes y reactivas, al decir de Soares Netto, se las considera como sensores celulares de peróxido de hidrógeno.

“En los últimos años, el peróxido de hidrógeno ha dejado de ser tenido únicamente como un villano, que sirve para oxidar proteínas y el ADN y causar daños celulares. Estudios recientes han demostrado que también actúa como un agente señalizador. Para ello es necesario que haya una interacción con las peroxirredoxinas”, comentó el investigador.

Tal como explicó Soares Netto, algunos tipos de cáncer y de enfermedades neurodegenerativas pueden estar relacionados con fallas en esa señalización mediada por el peróxido de hidrógeno. “Las peroxirredoxinas, al modular el nivel de peróxido en las células, actúan indirectamente en el mantenimiento de la homeostasis celular redox, cuya desregulación está implicada en diversas enfermedades de carácter genético o infeccioso”, explicó.

Este estudio formó parte de la tesis doctoral de Carlos Abrunhosa Tairum Junior en la Unesp, investigación para la cual contó con el apoyo de la FAPESP.

En el trabajo publicado en Scientific Reports, los investigadores demostraron el papel catalítico-estructural de aminoácidos Treonina-Serina, que se conservan completamente en todas las peroxirredoxinas. “Estos aminoácidos modulan grandes alteraciones estructurales en peroxirredoxinas, con repercusiones en la actividad catalítica”, dijo Soares Netto.

Puede leerse el artículo intitulado “Catalytic Thr or Ser Residue Modulates Structural Switches in 2-Cys Peroxiredoxin by Distinct Mechanisms” en el siguiente enlace: nature.com/articles/srep33133.

En tanto, al artículo intitulado “Ohr plays a central role in bacterial responses against fatty acid hydroperoxides and peroxynitrite” puede accederse en la siguiente dirección electrónica: pnas.org/content/114/2/E132.