Enzima de vagalume pode ser usada como indicador de pH intracelular

Aplicação foi sugerida por pesquisadores da UFSCar em artigo publicado na revista Photochemical and Photobiological Sciences

Por Noêmia Lopes

Agência FAPESP – Em um artigo publicado na revista Photochemical and Photobiological Sciences, pesquisadores da Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), campus de Sorocaba, demonstraram a possibilidade de utilização de enzimas luciferases de vagalumes como indicadores de pH intracelular em bactérias, uma aplicação até então inédita.

A demonstração dessa aplicação foi realizada durante o doutorado de Gabriele Verônica de Mello Gabriel, do programa de pós-graduação Genética Evolutiva e Biologia Molecular, sob a orientação de Vadim Viviani, coordenador do Laboratório de Bioquímica e Biotecnologia de Sistemas Bioluminescentes da UFSCar.

Desde o seu mestrado, realizado no âmbito do programa de pós-graduação Biotecnologia e Monitoramento Ambiental, Mello Gabriel avaliava a possibilidade de uso da luciferase do vagalume Macrolampis sp2, encontrado na Mata Atlântica, como indicador de pH intracelular de bactérias – para o que Viviani solicitara uma patente em 2005.

“Já se sabia que luciferases de vagalumes mudam a cor da bioluminescência do verde-amarelo para o vermelho em pH ácido, sob altas temperaturas ou na presença de metais pesados. Agora, demonstramos que a razão entre a intensidade de luz vermelha e luz verde pode ser efetivamente utilizada para indicar o pH intracelular em bactérias”, disse Viviani à Agência FAPESP.

De acordo com o pesquisador, o avanço abre caminho para a utilização da luciferase do Macrolampis sp2 como indicador de pH em outras células, como de mamíferos – o que, por sua vez, pode ser útil para acompanhar mudanças de pH associadas a processos biológicos patológicos como cancerificação, inflamação, acidose e apoptose.

Trata-se de um novo tipo de aplicação para as luciferases, que há décadas já são usadas como marcadores luminosos de expressão gênica em células.

“A vantagem adicional de nossa recente descoberta é possibilitar que um único gene de luciferase acompanhe mais de um evento fisiológico intracelular. Por exemplo, analisar o estado energético das células – calculado por meio da intensidade de luz, que é proporcional ao conteúdo intracelular de trifosfato de adenosina [ATP] – e ao mesmo tempo sua acidez – por meio da mudança do parâmetro espectral, ou seja, da cor da luz”, disse Viviani. “Não por acaso, a morte celular é acompanhada por diminuição dos níveis de ATP e acidificação.”

Em continuidade aos estudos de doutorado, Mello Gabriel agora investigará a aplicabilidade da luciferase do Macrolampis sp2 em células de mamíferos, em parceria com pesquisadores do National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), de Tsukuba, Japão.

“Aqui em nosso laboratório, o passo seguinte será avaliar o uso da enzima como biossensor intracelular de metais pesados como cobre, zinco e mercúrio, a fim de detectar a presença de toxicidade em água”, afirmou o pesquisador.

Segundo Viviani, a intenção é desenvolver um centro de aplicações biofotônicas de luciferases e bioluminescência para aplicações ambientais e biomédicas.

Cores de bioluminescência

Em outro artigo, publicado em julho de 2014 na revista Biochemistry, os pesquisadores da UFSCar, em parceria com colaboradores da University of Electro-Communications (UEC), em Tóquio, no Japão, exploraram o mecanismo de determinação das cores de bioluminescência pelas luciferases de besouros.

A cor da bioluminescência de vagalumes e outros besouros varia do verde ao vermelho, empregando a mesma reação bioquímica com os mesmos reagentes: luciferina (pigmento fluorescente que, ao ser oxidado, age como emissor de luz), energia armazenada nas moléculas de ATP, oxigênio e enzimas luciferases.

“Embora a reação seja idêntica entre as espécies, pequenas variações na estrutura das enzimas luciferases e nas propriedades químicas de seu sítio ativo [bolsão da proteína onde ocorre a reação química de oxidação da luciferina, resultando na produção de luz] são responsáveis pela modulação de cores”, disse Viviani.

A fim de entender melhor tais variações, o pesquisador japonês Takashi Hirano (UEC) sintetizou análogos de luciferina – compostos produzidos a partir do substrato original, mas com partes da molécula modificadas que ajudaram a identificar os grupos químicos da molécula de luciferina que interagem com a luciferase para modular as cores de bioluminescência.

Já os pesquisadores brasileiros caracterizaram as propriedades de bioluminescência desses análogos sintetizados no Japão, utilizando para tanto um extenso repertório de luciferases, clonadas e modificadas por engenharia genética, de espécies brasileiras que emitem diferentes cores de luz (verde, verde-amarelo, verde-azulado, amarelo, laranja e vermelho). Esse repertório de luciferases multicoloridas é fruto de clonagens e engenharia genética conduzidas durante mais de 15 anos por Viviani e seu grupo de pesquisa.

“Com esta abordagem combinada, envolvendo a modificação tanto da estrutura química da luciferina como do sítio ativo das luciferases, identificamos a forma química mais provável da molécula emissora de luz [oxiluciferina], bem como mapeamos algumas das interações físicas e químicas do sítio ativo da luciferase com essa molécula emissora, responsáveis pelas cores de luz”, disse o pesquisador.

“Além de ajudar a desvendar o mistério por trás das cores de bioluminescência dos vagalumes, esse estudo ajuda a orientar novas diretrizes para a engenharia das enzimas luciferases e a química combinatória, visando aumentar a faixa de cores dos ensaios bioluminescentes, amplamente usados nas áreas biomédica e ambiental.”

A pesquisa contou ainda com a participação do aluno de iniciação científica Deimison Rodrigues Neves, do doutorando Danilo Trabuco do Amaral e da pós-doutoranda Rogilene Aparecida Prado.

Amydetes vivianii

Entre as luciferases clonadas utilizadas pelo grupo da UFSCar para a investigação sobre o mecanismo de determinação de cores de bioluminescência está a da espécie Amydetes vivianii, descrita no início deste ano e batizada em homenagem ao pesquisador Viviani, que a descobriu no campus de Sorocaba, logo após a sua inauguração, em 2006.

A descrição foi feita pelo taxonomista Luiz Felipe Lima, aluno de doutorado do Laboratório de Entomologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

A espécie é conhecida por produzir um brilho verde-azulado intenso e contínuo e teve sua enzima luciferase clonada por Viviani e seus alunos em 2011, com vistas à utilização como reagente para quantificação de ATP celular, como marcador bioluminescente e como biossensor de agentes tóxicos.

“A descoberta e a descrição de mais uma espécie de vagalume, alvo de pesquisas que já resultaram na clonagem de enzimas com interesse biotecnológico, demonstram a importância e a urgência dos estudos e da preservação da biodiversidade nativa dos biomas brasileiros”, disse Viviani. Este último projeto foi financiado por um auxílio regular vinculado ao programa Biota-FAPESP.

Segundo o pesquisador, as maiores ameaças a espécies de vagalumes como a Amydetes vivianii são a redução de habitats resultante do crescimento urbano e de monoculturas e o aumento da poluição luminosa emitida pelos centros urbanos.

“Mas não é no Estado de São Paulo que está acontecendo o mais grave, e sim no Centro-Oeste e na Amazônia, onde regiões inteiras foram desmatadas para dar lugar a monoculturas extensivas de soja e cana-de-açúcar”, sublinhou.

O pesquisador alerta que na região de Costa Rica, em Mato Grosso do Sul, dezenas de espécies de vagalumes desapareceram, entre as quais duas (larva-trenzinho e larva de cupinzeiros luminosos) cujos estudos já resultaram em produtos tecnológicos de importância à saúde humana.

“Vagalumes constituem importantes bioindicadores de qualidade ambiental. Seu desaparecimento, além da perda da beleza natural, traz um alerta vermelho aos desavisados: nosso meio ambiente está colapsando e a sociedade perderá os benefícios que ele pode fornecer na forma de recursos renováveis e produtos importantes para a saúde humana e ambiental.”