Una enzima de luciérnaga puede emplearse como indicador de pH intracelular

Científicos brasileños sugirieron esta aplicación en un artículo publicado en la revista Photochemical and Photobiological Sciences

Por Noêmia Lopes

Agência FAPESP – En un artículo publicado en la revista Photochemical and Photobiological Sciences, científicos de la Universidad Federal de São Carlos (UFSCar), del campus de la localidad paulista de Sorocaba, en Brasil, demostraron la posibilidad de utilizar enzimas luciferasas de luciérnagas como indicadores de pH intracelular en bacterias, una aplicación hasta entonces inédita.

La demostración de esta aplicación se concretó durante el doctorado de Gabriele Verônica de Mello Gabriel, del programa de posgrado en Genética Evolutiva y Biología Molecular, bajo la dirección de Vadim Viviani, coordinador del Laboratorio de Bioquímica y Biotecnología de Sistemas Bioluminescentes de la UFSCar.

Desde su maestría, realizada en el programa de posgrado en Biotecnología y Monitoreo Ambiental, Mello Gabriel evaluaba la posibilidad de uso de la luciferasa de la luciérnaga Macrolampis sp2, hallada en el Bosque Atlántico, como un indicador de pH intracelular de bacterias, para lo cual Viviani había solicitado una patente en 2005.

“Ya se sabía que las luciferasas de las luciérnagas alteran el color de la bioluminescencia del verde amarillo al rojo en pH ácido, a altas temperaturas o en presencia de metales pesados. Pero ahora demostramos que la razón entre la intensidad de luz roja y de luz verde puede efectivamente utilizarse para indicar el pH intracelular en bacterias”, declaró Viviani a Agência FAPESP.

De acuerdo con el científico, este avance abre el camino hacia la utilización de la luciferasa de la Macrolampis sp2 como indicador de pH en otras células, tales como las de mamíferos, lo cual, a su vez, puede ser útil para acompañar cambios de pH asociados a procesos biológicos patológicos tales como el cáncer, las inflamaciones, la acidosis y la apoptosis.

Se trata de un nuevo tipo de aplicación de las luciferasas, que se emplean desde hace décadas como marcadores luminosos de expresión génica en células.

“La ventaja adicional de nuestro reciente descubrimiento radica en que permite que un solo gen de luciferasa acompañe más de un evento fisiológico intracelular. Por ejemplo, el análisis del estado energético de las células –calculado a través de la intensidad de la luz, que es proporcional al contenido intracelular de trifosfato de adenosina [ATP]– y al mismo tiempo su acidez, a través de la alteración del parámetro espectral, es decir, del color de la luz”, dijo Viviani. “No por casualidad, la muerte celular está acompañada por una disminución de los niveles de ATP y una acidificación.”

Como continuación de sus estudios doctorales, Mello Gabriel investigará ahora la aplicabilidad de la luciferasa del Macrolampis sp2 en células de mamíferos, en colaboración con científicos del National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), de Tsukuba, Japón.

“Acá en nuestro laboratorio, el siguiente paso consistirá en evaluar el uso de la enzima como biosensor intracelular de metales pesados tales como el cobre, el cinc y el mercurio, con el fin de detectar la presencia de toxicidad en el agua”, afirmó el investigador.

Según Viviani, la intención es desarrollar un centro de aplicaciones biofotónicas de luciferasas y bioluminescencia para aplicaciones ambientales y biomédicas.

Los colores de la bioluminescencia

En otro artículo, publicado en julio de 2014 en la revista Biochemistry, los investigadores de la UFSCar, en colaboración con colegas de la University of Electro-Communications (UEC) de Tokio, Japón, exploraron el mecanismo de determinación de los colores de la bioluminescencia por las luciferasas de escarabajos.

El color de la bioluminescencia de las luciérnagas y de otros escarabajos varía del verde al rojo. Emplean la misma reacción bioquímica con los mismos reactivos: luciferina (un pigmento fluorescente que, al oxidarse, actúa como emisor de luz), energía almacenada en las moléculas de ATP, oxígeno y enzimas luciferasas.

“Aunque la reacción sea idéntica entre las especies, pequeñas variaciones en la estructura de las enzimas luciferasas y en las propiedades químicas de su sitio activo [el bolsón de la proteína en donde se produce la reacción química de oxidación de la luciferina, que resulta en la producción de luz] son responsables de la modulación de los colores”, dijo Viviani.

Con el fin de entender mejor dichas variaciones, el investigador japonés Takashi Hirano (UEC) sintetizó análogos de luciferina, compuestos producidos a partir del sustrato original, pero con partes de la molécula modificadas, que ayudaron a identificar los grupos químicos de la molécula de luciferina que interactúa con la luciferasa para modular los colores de bioluminescencia.

En tanto, los científicos brasileños caracterizaron las propiedades de bioluminescencia de esos análogos sintetizados en Japón utilizando para ello un extenso repertorio de luciferasas, clonadas y modificadas mediante ingeniería genética, de especies brasileñas que emiten distintos colores de luz (verde, verde amarillo, verde azulado, amarillo, anaranjado y rojo). Ese repertorio de luciferasas multicolores es fruto de clonaciones e ingeniería genética, en un trabajo realizado durante más de 15 años por Viviani y su grupo de investigación.

“Con este abordaje combinado, que comprende la modificación tanto de la estructura química de la luciferina como del sitio activo de las luciferasas, identificamos la forma química más probable de la molécula emisora de luz [oxiluciferina], como así también mapeamos algunas de las interacciones físicas y químicas del sitio activo de la luciferasa con esa molécula emisora, responsables de los colores de la luz”, dijo el investigador.

“Aparte de ayudar a develar el misterio referente a los colores de bioluminescencia de las luciérnagas, este estudio ayuda a elaborar nuevas directrices para la ingeniería de las enzimas luciferasas y la química combinatoria, con miras a aumentar la franja de colores de los ensayos bioluminescentes, ampliamente utilizados en las áreas biomédica y ambiental.”

La investigación contó también con la participación del alumno de iniciación científica Deimison Rodrigues Neves, del doctorando Danilo Trabuco do Amaral y de la posdoctoranda Rogilene Aparecida Prado.

Amydetes vivianii

Entre las luciferasas clonadas que utilizó el grupo de la UFSCar para la investigación sobre el mecanismo de determinación de los colores de la bioluminescencia se encuentra la de la especie Amydetes vivianii, descrita al comienzo de este año y bautizada así en honor al investigador Viviani, quien la descubrió en el campus de Sorocaba luego de su inauguración en 2006.

La descripción estuvo a cargo del taxónomo Luiz Felipe Lima, alumno de doctorado del Laboratorio de Entomología de la Universidad Federal del Río de Janeiro (UFRJ).

La especie es conocida porque produce un brillo verde azulado intenso y continuo, y la clonación de su enzima luciferasa estuvo a cargo de Viviani y sus alumnos en 2011, para su utilización como reactivo en la cuantificación de ATP celular, como marcador bioluminescente y como biosensor de agentes tóxicos.

“El descubrimiento y la descripción de una nueva especie de luciérnaga, objeto de investigaciones que ya resultaron en la clonación de enzimas de interés biotecnológico, demuestran la importancia y la urgencia de los estudios y de la preservación de la biodiversidad nativa de los biomas brasileños”, dijo Viviani. Este último proyecto contó con financiación mediante una ayuda regular vinculada al programa Biota-FAPESP.

Según el investigador, las mayores amenazas a las especies de luciérnagas tales como la Amydetes vivianii son la reducción de hábitats resultante del crecimiento urbano y de los monocultivos, y el aumento de la contaminación luminosa emitida por los centros urbanos.

“Pero no es en el estado de São Paulo donde está ocurriendo lo más grave, sino en el centro-oeste de Brasil y en la Amazonia, donde regiones enteras han sido deforestadas para dar lugar a monocultivos extensivos de soja y caña de azúcar”, subrayó.

El investigador advierte que en la zona de Costa Rica, en Mato Grosso do Sul, decenas de especies de luciérnagas han desaparecido, entre las cuales dos (un fengódido y la larva de los termiteros luminosos) cuyos estudios han resultado en productos tecnológicos de importancia para la salud humana.

“Las luciérnagas constituyen importantes bioindicadores de la calidad ambiental. Su desaparición, además de la pérdida de la belleza natural, implica un alerta rojo para los imprudentes: nuestro medio ambiente está colapsándose y la sociedad perderá los beneficios que puede suministrarnos bajo la forma de recursos renovables y productos importantes para la salud humana y ambiental.”